黑龙江省松树天牛高致病力虫生真菌的筛选与鉴定

以获取对松树天牛高致病的生防真菌为目标,从黑龙江省森林土壤中初步分离得到18株虫生真菌,分别采用爬行法测定其对松树天牛幼虫、成虫的致病力,同时测定高致病力菌株的菌丝生长速度和产孢量,对高致病力菌株进行种类鉴定。结果表明:18株虫生真菌对松树天牛幼虫、成虫均表现出不同程度的致病力。其中菌株M14-1、H_(2)表现出较强的致病力,在处理天牛幼虫、成虫的6 d,累计死亡率均达到了100%,菌株M14-1、H_(2)菌落生长速度快,产孢量大;在90 mm×15 mm(直径×深度)的马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基的培养皿上培养15 d时,菌落直径分别为5.68、4.91 cm,产孢量分别为3.86×10^(8)、4.1×10^(8)个·板^(-1)。在孢子浓度为10^(7)个·mL^(-1)时,菌株M14-1、H_(2)对松树天牛成虫的半致死时间(LT_(50))分别为4.15、4.31 d。经形态学和分子生物学鉴定,菌株M14-1、H_(2)皆属于金龟子绿僵菌(Mertarhizium anisopliae)。

桦褐孔菌内生真菌的组成研究

为探求桦褐孔菌腐朽木不同腐朽区域内生真菌组成,2021年7月,以采自黑龙江省漠河市的桦褐孔菌腐朽木为研究对象,根据腐朽程度不同将腐朽木横截面从内向外依次划分为腐朽区(木材质地结构发生变化,木质素已基本被降解)、变色区(木质部细胞的细胞壁初步降解,颜色变深)、健康区和菌核区。通过真菌培养技术和高通量测序技术研究桦褐孔菌腐朽木内真菌组成。研究结果显示:桦褐孔菌在木材中扩展严重影响了白桦木不同区域内生真菌的种类组成与物种丰富度。在PDA培养基上从白桦树桦褐孔菌腐朽木不同区域分离出的内生真菌组成有较大差别,腐朽区分离到的内生真菌较多,菌核区域分离到种类最少;高通量测序分析结果表明,健康区的物种丰富度(Chaol)和物种数目(Observed species)指数都明显高于其他区域,说明健康区的物种丰富度较高。变色区内生真菌数量明显减少,腐朽区的内生真菌数量比变色区略有增加,菌核区真菌种类最少。

欧美山杨杂种工厂化育苗技术

为了降低欧美山杨杂种无性系的繁殖成本,以欧美山杨杂种(Populus tremula×P. tremuloides)优良无性系为研究材料,用自来水和绵白糖替代蒸馏水和蔗糖配制培养基,结合试管苗瓶外生根和扦插技术,提出了适合欧美山杨杂种工厂化生产技术的工艺体系,为欧美山杨杂种生产走上工厂化、产业化之路提供参考。

深绿木霉1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶基因的克隆及表达

以深绿木霉(Trichoderma atroviride)ACCC30153为试材,应用聚合酶链式反应(PCR)技术克隆获得1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶ACCD基因的c DNA全长。结果表明:此基因的c DNA编码区序列全长1 083 bp,编码区可编码360个氨基酸。经Blast P相似性分析,其属于Try-synth-beta-Ⅱ家族,与里氏木霉(T.reesei)氨基酸序列XP-006967764的同源性最高,达到91%。在5种不同诱导条件下,ACCD基因的表达量均有明显变化。在C、N饥饿培养基中分别培养8 h与16 h时,ACCD基因表达量达到最大值,为未诱导时的22.7倍与22.4倍;在山新杨叶粉与茎粉的诱导下,ACCD的表达量分别在培养的24 h与2 h达到最大,为未诱导的22.6倍与27.3倍。

二色补血草硫氧还蛋白过氧化物酶基因LbTPx的克隆及其表达

从二色补血草(Limonium bicolor)cDNA文库中分离出一个新的硫氧还蛋白过氧化物酶基因(LbTPx)全长cDNA序列。基因全长1 016 bp,其中:5’非翻译区146 bp,3’非翻译区69 bp,开放读码框(ORF)801 bp,共编码266个氨基酸;编码蛋白的分子质量为47.99×10-24kg,理论等电点为(pI)8.83。利用荧光定量PCR方法研究了二色补血草LbTPx基因在NaCl、ABA、CuSO4、ZnCl2和CdCl2胁迫下不同时间的表达模式。结果表明:NaCl和CuSO4处理均能诱导LbTPx基因在二色补血草根和叶中的表达;ABA、ZnCl2和CdCl2处理则只能诱导LbTPx基因在二色补血草叶中的表达,而抑制其在二色补血草根中的表达。

二色补血草LbGST基因的原核表达载体构建与表达

从二色补血草(Limonium bicolor)中分离出一个编码谷胱甘肽硫转移酶(LbGST)基因,并将该基因构建到pGEX-4T-2原核表达载体,转入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21中,利用0.1 mmol/L的IPTG诱导该基因在大肠杆菌BL21中进行表达。SDS-PAGE检测表明,出现了特异的分子量为50 kDa左右的融合蛋白,说明该基因在大肠杆菌中成功表达,该基因的成功表达为分离纯化LbGST蛋白并研究其功能奠定了基础。

二色补血草LbARP基因的克隆及其表达分析

从二色补血草(Limonium bicolor)cDNA文库中分离出一个生长素抑制蛋白基因LbARP(GenBank登录号为KF886022)。该基因全长698 bp,含有3个外显子和2个内含子,开放读码框(ORF)387 bp,共编码128个氨基酸,推测蛋白质分子量为13.84 kDa,理论等电点为9.69。多序列比对结果显示,该基因编码的氨基酸序列与其他植物的ARP蛋白序列相似性达到50%以上,具有生长素抑制基因家族的保守结构域。荧光定量PCR结果表明,LbARP基因能够对NaCl、ABA、CuSO4、CdCl2及ZnCl2等非生物胁迫作出应答。

松口蘑菌丝分离及其RAPD-PCR鉴定

采用组织分离法,对东宁县的松口蘑进行了分离培养。通过显微观察及RAPD-PCR技术对松口蘑子实体及其相应的培养物之间进行了亲缘关系鉴定。结果表明,菌褶为松口蘑组织分离的最适宜部位,其最佳分离培养基为PWJ,即PDA+黑木耳二级种浸出液+麦麸。RAPD-PCR结果显示,松口蘑子实体与分离物之间的DNA指纹相似系数在0.97～1.00之间,表明松口蘑子实体与其相应的培养物在种质上是一致的。

棘孢木霉葡聚糖酶基因Glu1的克隆及原核表达

从棘孢木霉(Trichoderma asperellum)ACCC30536中克隆获得一个葡聚糖酶基因Glu1,其cDNA全长984bp,编码327个氨基酸。该葡聚糖酶属于Glyco-hydro-12家族,推测为β-1,4-葡聚糖酶,与深绿木霉IMI 206040的Glycohydro-12家族蛋白(XP_013940397.1)有91%相似性,且亲缘关系较近。运用qRT-PCR技术检测9种诱导条件下棘孢木霉Glu1基因的表达水平,结果表明,Glu1基因能参与棘孢木霉对山新杨(Populus davidiana×P.alba var.pyramidlis)或杨树病原菌的识别。构建原核表达载体并获得重组蛋白rGlu1。酶活特性分析结果表明,该酶最适pH为4.5,最适温度为45℃,且酶活性随诱导时间延长逐渐升高,在5h达到稳定。

深绿木霉对山新杨生长及抗叶枯病能力的影响

利用深绿木霉(Trichoderma atroviride)ACCC30153菌株不同孢子悬浮液根施山新杨(Populus davidiana×P. alba var. pyramidlis)移栽苗,测定了山新杨根系土壤肥力、生物量、生理酶活性以及抗叶枯病能力,探讨了深绿木霉促进木本植物生长和提高抗叶枯病的能力。结果表明:深绿木霉处理后的山新杨根系土壤p H呈弱酸性,有机质、水解氮和有效磷质量分数明显增加,土壤肥力增强;105、107个·mL^(-1)深绿木霉孢子悬浮液处理60 d的山新杨株高与对照相比分别增长了30.33%和32.91%,地茎、根长、叶片数、鲜质量和干质量都较高;105个·mL^(-1)的深绿木霉孢子悬浮液处理的山新杨抗氧化还原酶(SOD、POD、CAT)和防御酶(PAL和PPO)活性也明显升高;接种叶枯病病原菌后,105个·mL^(-1)的深绿木霉孢子悬浮液处理的山新杨叶片感病面积最小,为山新杨叶片的1.65%。

兴安落叶松人工林经营决策分析

对南岔林业局兴安落叶松人工林的不同年龄采伐和更新的调查资料进行分析得出:对于人工落叶松近熟林,在其采伐后更新树种的选择上应以云杉、红松为主,不宜选择落叶松造林;在采伐方式上,对落叶松人工近熟林的经营宜采用大强度间伐,每公顷保留400株为宜,不宜采用大面积皆伐和带状皆伐方式;落叶松人工林经济成熟年龄应定15～20 a;在一般公益林区,落叶松人工林数量成熟年龄应定在25-30 a为宜。

叶腋增殖途径快速繁殖欧美杂种山杨

以欧美杂种山杨腋芽为外植体进行组织培养,筛选出较为理想的芽分化、增殖和生根培养基,建立起有效的叶腋增殖快繁途径。选出初始培养基为WPM+BA1. 0mg·L-1;分化培养基为NT+BA1. 0mg·L-1 +KT0. 5mg·L-1;生根培养基为1 /2WPM+NAA0. 3mg·L-1 +IAA0. 05mg·L-1。根据试验结果,采用分化培养基NT+BA1. 0mg·L-1 +KT0. 5mg·L-1及抽枝培养基WPM+BA0. 3mg·L-1 +2%蔗糖对试管苗进行交替培养,观察并统计四个继代的繁殖系数,得出每个继代芽增殖系数分别为5. 22、4. 46、4. 87、5. 23。

毛果杨丝氨酸蛋白酶抑制子PtrSPI的抗虫能力分析

【目的】研究毛果杨丝氨酸蛋白酶抑制子PtrSPI的抗虫功能,为开发新型林木抗虫生物农药奠定基础。【方法】本研究通过研究毛果杨丝氨酸蛋白酶抑制子基因PtrSPI的启动子及其在舞毒蛾幼虫取食胁迫下的表达模式,分析PtrSPI基因功能;利用真核重组蛋白PtrSPI饲喂舞毒蛾幼虫,观察记录幼虫的取食量、体质量和死亡率,并测定取食后的幼虫体内丝氨酸蛋白酶活性,探讨PtrSPI蛋白的抗虫能力。【结果】结果表明毛果杨丝氨酸蛋白酶抑制子基因PtrSPI的启动子区域共包含5个与植物抗病虫相关的元件;经舞毒蛾幼虫取食后,毛果杨叶片的PtrSPI基因呈先降后升的表达模式,且在取食30 h达到峰值,为空白对照的2.03倍;高质量浓度重组蛋白PtrSPI(300和500 mg/mL)对舞毒蛾幼虫的取食量和体质量有显著的抑制作用,而且分别在取食4和6 d后舞毒蛾幼虫死亡率均达到60%以上,而幼虫体内丝氨酸蛋白酶的活性在取食初期显著上升。【结论】本研究验证了毛果杨丝氨酸蛋白酶抑制子PtrSPI的抗虫能力,可为进一步研发新型无公害抗虫生物农药提供理论基础和研究材料。

3种木霉菌混合对山新杨生理酶活性及其幼苗生长的影响

[目的]分析混合木霉菌诱导杨树系统抗病性的生理生化机制,筛选出提高杨树抗病性的最佳孢子浓度。[方法]选用3种木霉菌混合孢子根施1年生山新杨移栽苗,分别于不同时间测定山新杨叶部组织的生理酶活性及其生长量变化。[结果]经混合木霉菌处理后,山新杨叶片中的生理酶活性均明显高于对照,其中以1×106个/ml浓度水平处理效果最好;根施混合木霉菌后山新杨的生长量均有所提高。[结论]混合木霉菌能够提高杨树生理酶活性,并且具有促进杨树苗生长的作用。

刺激植物响应蛋白基因Epl1的载体构建及酵母转化

[目的]构建刺激植物响应蛋白Epl1基因的真核表达载体,筛选多拷贝酵母转化子。[方法]以深绿木霉(Trichoderma atroviride)ACCC30153的cDNA为模板进行PCR获得Epl1基因片段,并将目的片段插入表达载体pPIC9K的相应位置,获得重组表达载体,并将pPIC9K-Epl1转入毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中,并用不同中终浓度的遗传霉素G418筛选多拷贝重组酵母菌株。[结果]对重组载体进行PCR及双酶切检测为阳性;在含有终浓度为2 mg/ml遗传霉素G418的YPD平板上筛选得到7株多拷贝的转化子GS115-Epl1,经PCR鉴定1株转化子呈阳性。[结论]Epl1基因的载体构建及多拷贝酵母转化子筛选为以后大量分离纯化Epl1蛋白并研究其功能奠定基础。

深绿木霉发酵液对山新杨防御酶活性的影响

[目的]探究深绿木霉发酵液对山新杨5种重要植物防御酶活性的影响,为木霉菌代谢产物在木本植物上的应用奠定基础。[方法]测定不同稀释倍数深绿木霉发酵液对山新杨组培移栽苗的超氧化物歧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶、苯丙氨酸解氨酶以及多酚氧化酶活性的影响。[结果]深绿木霉发酵液处理后山新杨叶片组织中防御酶活性明显高于对照组,且不同稀释倍数发酵液之间存在较大差异,其中以50倍和100倍稀释液处理效果最佳。[结论]为今后利用深绿木霉代谢物质防治杨树病害提供了理论依据。

毛果杨丝氨酸蛋白酶抑制剂基因PtrSPI的克隆及真核表达

利用PCR技术从毛果杨(Populus trichocarpa)中分离得到1条丝氨酸蛋白酶抑制剂基因PtrSPI,该基因cDNA编码区全长为1176 bp,可编码391个氨基酸。BlastP预测结果显示,该丝氨酸蛋白酶抑制剂属于SERPIN超家族。多序列比对结果表明,毛果杨PtrSPI基因的氨基酸序列与已报道的胡杨(P.euphratica)丝氨酸蛋白酶抑制剂氨基酸序列XP_011030699同源性最高,相似性为92%,且蛋白的C端氨基酸序列都含有高度保守的反应中心环(RCL)。在此基础上,成功构建了PtrSPI基因的重组真核表达载体pPICK-PtrSPI并获得了重组毕赤酵母菌株GS115-PtrSPI。利用终质量分数为0.5%甲醇诱导重组真核蛋白表达,SDS-PAGE电泳结果显示,在42648.45处出现了重组蛋白,与预期值一致。

蒙古栎烂皮病病原菌鉴定

2019年7月,在黑龙江省加格达奇地区观察到一种蒙古栎(Quercus mongolica)树枝烂皮病。病枝最初呈浅红色至红棕色,伴有浅棕色至深棕色凹陷性病变,后期产生许多灰黑色至深黑色肿块。为确定引起蒙古栎烂皮病的病原种类及为针对性防治提供理论依据,该研究采集发病标本,利用单孢分离法对病原菌进行分离纯化及形态特征观测,记录分生孢子器、分生孢子梗及分生孢子大小。对rDNA-ITS、EF1-α和LSU基因进行测序,使用MEGA手动编辑比对,构造系统发育树。根据柯赫氏法则,对该病害进行接种,并从接种枝条中再次分离出该病原菌。在病害接种实验中,仅烧伤组表现出典型症状,说明自然条件下该病原菌不能穿透表皮或通过伤口侵入;多发生于蒙古栎幼龄枝条和长势衰弱的枝条,属于弱寄生病害。结合形态学和系统发育分析,结果表明引起蒙古栎烂皮病的病原菌为壳囊孢属菌(Cytospora ceratosperma,C.ceratosperma),蒙古栎为C.ceratosperma的国内新寄主。

棘孢木霉ACCC30536葡聚糖酶基因的克隆及表达

以棘孢木霉（Trichoderma asperellum）ACCC30536菌株为试材,采用聚合酶链式反应（PCR）技术克隆获得葡聚糖酶GH71基因的全长c DNA序列。结果表明：此基因的c DNA编码区序列全长1 296 bp,编码区可编码431个氨基酸。经Blast P相似性分析,其属于GH99~GH71超家族,与深绿木霉（T.atroviride）氨基酸序列XP_013941146的同源性最高,达到94%。7种不同诱导条件下,GH71基因的表达量变化明显。在2种病原菌细胞壁的诱导下,GH71基因的表达均呈先上升后下降又上升的趋势,在培养的12 h时达到最大值,分别为未诱导时的24.3倍和23.9倍。而在这2种病原菌发酵液的诱导下,GH71基因的表达均呈先下降后上升的趋势。在山新杨茎与叶的诱导下,GH71基因的表达量在24 h最大,分别为未诱导的25.4倍和25.2倍;在山新杨根的诱导下,GH71基因的表达量在48 h达到最大,是未诱导的28.1倍。

让责任心与孩子共同成长

一个没有责任感的人即使有知识和技能，也不会发挥出生命的真正价值。在教学中，教师应培养幼儿的责任感，形成健全的人格。