亚砷酸钠对SD大鼠肝组织纤维化及上皮-间质转化相关蛋白表达的影响

[背景]长期砷暴露易造成其在肝脏内蓄积,从而导致肝脏病变。相关研究显示间充质细胞在肝纤维化中起着重要作用,且上皮-间质转化(EMT)是间充质细胞的主要来源之一。[目的]探讨不同剂量亚砷酸钠染毒对SD大鼠肝组织纤维化及EMT相关蛋白表达的影响。24只健康初断乳SD大鼠随机分为4组,每组6只,雌雄各半,分别为对照组(10 mL·kg^(-1)生理盐水)、2.5 mg·kg^(-1)亚砷酸钠组、5.0 mg·kg^(-1)亚砷酸钠组和10.0 mg·kg^(-1)亚砷酸钠组,灌胃染毒,每天一次,每周六次。每周称重大鼠一次,持续36周后收集大鼠血清及肝组织,称重并计算脏器系数。苏木精-伊红(HE)染色和马松(Masson)三色染色观察大鼠肝纤维化损伤病理改变程度;酶联免疫吸附法(ELISA)检测大鼠血清中肝纤维化相关蛋白透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)、Ⅲ型前胶原氨基端肽(PⅢNP)和Ⅳ型胶原(COL-Ⅳ)分泌水平;Western blotting法检测大鼠肝组织中肝星状细胞(HSCs)活化相关蛋白α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和转化生长因子β1(TGF-β1),以及EMT相关标志蛋白E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(Ncadherin)、波形蛋白(Vimentin)、锌指转录因子(Snail)表达水平。[结果]与对照组相比,染毒第36周时,10.0 mg·kg^(-1)亚砷酸钠组雌、雄大鼠体重均降低(P<0.05),肝脏系数增加(P<0.05)。病理染色结果显示:各亚砷酸钠染毒组大鼠肝组织可见大量炎性细胞浸润,肝实质细胞液化坏死、变性,同时,大鼠肝组织胶原纤维阳性着色面积均且随染砷剂量增加而逐渐上升(P<0.05)。ELISA和Western blotting结果显示:5.0、10.0 mg·kg^(-1)亚砷酸钠组HA、LN、PⅢNP、COL-Ⅳ分泌水平较对照组和2.5 mg·kg^(-1)亚砷酸钠组增加(P<0.05);与对照组相比,各染砷剂量组大鼠肝组织中α-SMA、TGF-β1蛋白表达均上升(P<0.05),E-cadherin蛋白表达水平下降(P<0.05),而N-cadherin、Vimentin、Snail表达水平升高(P<0.05)。[结论]亚砷酸钠暴露可诱导SD大鼠HSCs活化及肝纤维化损伤,导致细胞外基质分泌水平增加,同时伴有肝组织EMT,提示EMT与砷致肝纤维化损伤过程密切相关。

丝裂原诱导基因6在砷致人肝星状细胞活化及细胞外基质沉积中的作用

[背景]砷是一种环境毒物,长期或过量砷暴露可致机体肝纤维化损伤,其具体机制尚不清楚;丝裂原诱导基因6(Mig-6)在多种疾病或癌症中具有保护作用,但其在砷致肝纤维化损伤过程的作用尚不清楚。[目的]探讨Mig-6在亚砷酸钠(NaAsO_(2))致人肝星状细胞(HSC)活化及细胞外基质(ECM)沉积中的作用及机制。[方法]采用0、1.875、3.75、7.5、15μmol·L^(-1)NaAsO_(2)处理体外常规培养的人肝星状细胞株(Lx-2)24 h,另以7.5μmol·L^(-1)NaAsO_(2)处理Lx-2细胞0、12、24、48、72 h,到达处理终点收集细胞。进一步采用pcDNA3.1(+)/Mig-6质粒转染Lx-2细胞,并在此基础上以7.5μmol·L^(-1)NaAsO_(2)处理细胞24 h,另设空白对照组、pcDNA3.1(+)空载体转染组、pcDNA3.1(+)/Mig-6转染组、单独染砷组(7.5μmol·L^(-1));收集各组细胞及培养上清,Western blotting法检测Mig-6及Lx-2细胞活化相关蛋白[α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、转化生长因子β1(TGF-β1)]表达水平,ELISA法检测培养细胞上清中ECM主要成分[透明质酸(HA)、层黏连蛋白(LN)、Ⅳ型胶原(COL-Ⅳ)、Ⅲ型前胶原氨基端肽(PⅢNP)]的分泌水平。[结果]NaAsO_(2)处理Lx-2细胞后,与对照组(1.000±0.000)比较,3.75、7.5、15μmol·L^(-1)染砷组Mig-6蛋白表达水平降低(0.561±0.095、0.695±0.048、0.401±0.030)(P<0.05);染砷24、48、72 h后Mig-6蛋白表达水平(0.856±0.036、0.515±0.077、0.491±0.060)均较0 h时(1.000±0.000)降低(P<0.05)。过表达Mig-6后,Lx-2细胞活化相关蛋白检测结果显示,与对照组比较,单独染砷组α-SMA和TGF-β1蛋白表达水平均升高(P<0.05);而与单独染砷组比较,Mig-6过表达联合染砷组α-SMA、TGF-β1蛋白表达水平则降低(P<0.05);ELISA法检测结果显示,与对照组比较,单独染砷组HA、LN、PⅢNP、COL-Ⅳ分泌水平升高(P<0.05);而与单独染砷组比较,Mig-6过表达联合染砷组HA、LN、PⅢNP、COL-Ⅳ分泌水平则降低(P<0.05)。[结论]砷可下调HSC中Mig-6蛋白表达水平,过表达Mig-6可逆转砷暴露所引起的HSC活化及ECM沉积,提示Mig-6在砷所致HSC激活及ECM沉积中具有保护作用。

活性维生素D对亚砷酸钠致SD大鼠肝纤维化损伤的保护作用

目的探讨活性维生素D(vitamin D,VD)对亚砷酸钠(NaAsO_(2))致SD大鼠肝纤维化损伤的保护作用。方法健康初断乳SD大鼠18只,雌雄各半,按随机数字表法分为对照组(10 mL/kg生理盐水灌胃)、NaAsO_(2)染毒组(10 mg/kg NaAsO_(2)灌胃)、骨化三醇(VD_(3)的生物活性代谢物)干预组(10 mg/kg NaAsO_(2)灌胃,自第12周后NaAsO_(2)灌胃的同时给予1.0μg/kg骨化三醇灌胃),6 d/周,连续36周,每周称量并记录大鼠体重。采用酶联免疫吸附法检测各组大鼠血清25-羟维生素D_(3)[25(OH)D_(3)]含量及肝纤维化相关蛋白透明质酸(hyaluronic acid,HA)、层黏连蛋白(laminin,LN)、Ⅲ型前胶原氨基端肽(procollagenⅢN-terminal peptide,PⅢNP)、Ⅳ型胶原(Ⅳcollagen,COL-Ⅳ)的分泌水平;HE染色观察各组大鼠肝组织基本病理变化,Masson染色和Sirius Red染色观察各组大鼠肝组织纤维化及胶原沉积情况;蛋白免疫印迹(Western Blot)法检测各组大鼠肝组织纤维化相关标志物α-平滑肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、波形蛋白(Vimentin)的表达水平。结果NaAsO_(2)染毒36周后,NaAsO_(2)染毒组大鼠体重较对照组显著下降,给予骨化三醇干预后雌性大鼠体重较NaAsO_(2)染毒组明显增加(P<0.05)。肝脏系数结果显示NaAsO_(2)染毒组较对照组有所升高,而骨化三醇干预组与NaAsO_(2)染毒组相比有所降低,其中在雌性大鼠中差异有统计学意义(P<0.05)。NaAsO_(2)染毒组大鼠血清25(OH)D_(3)含量(436.82±74.37)ng/L明显低于对照组(550.21±29.16)ng/L(P<0.05),而骨化三醇干预后大鼠血清25(OH)D_(3)含量(1135.07±95.07)ng/L显著高于NaAsO_(2)染毒组(P<0.05)。与对照组相比,NaAsO_(2)染毒组大鼠肝组织HE染色显示肝细胞形态异常,肝组织结构紊乱,出现假小叶及脂肪空泡增多;Masson及Sirius Red染色亦发现NaAsO_(2)染毒组大鼠肝小叶结构异常,汇管区扩大变形并出现大量胶原纤维沉积,进一步分析显示其胶原沉积阳性着色面积较对照组明显增加(P<0.05);骨化三醇干预组大鼠肝组织上述改变较NaAsO_(2)染毒组明显改善(P<0.05)。Western Blot检测显示NaAsO_(2)染毒组大鼠肝组织中α-SMA、TGF-β1、Vimentin表达水平分别为1.12±0.21、1.12±0.26和1.31±0.15,显著高于对照组(0.57±0.10、0.64±0.13、0.72±0.16),ELISA检测进一步发现NaAsO_(2)染毒组大鼠血清肝纤维化相关因子HA、LN、PⅢNP、COL-Ⅳ分泌水平[(87.92±9.67)、(89.04±11.91)、(12.09±2.97)和(19.86±3.40)ng/mL]亦均高于对照组(P<0.05);而经过骨化三醇干预后,大鼠肝组织α-SMA、TGF-β1、Vimentin表达水平(0.68±0.16、0.85±0.21、0.84±0.09)和血清HA、LN、PⅢNP、COL-Ⅳ分泌水平[(54.29±7.23)、(55.56±9.43)、(6.49±1.08)和(10.15±1.99)ng/mL]均明显低于NaAsO_(2)染毒组(P<0.05)。结论VD_(3)的生物活性代谢物骨化三醇干预可有效减轻长期NaAsO_(2)暴露所致SD大鼠肝纤维化损伤程度。

Toll样受体4介导的炎症信号通路在无机砷致大鼠肝纤维化损伤中的作用

目的观察无机砷中毒大鼠肝组织中Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)信号通路相关蛋白及其磷酸化蛋白表达水平,探讨TLR4介导的炎症信号通路在砷致肝纤维化损伤中的作用。方法将健康初断乳SD大鼠18只,按体重(80~100 g)采用随机数字表法分为3组,每组6只,雌雄各半。对照组给予10 ml/kg生理盐水灌胃;亚砷酸钠(NaAsO_(2))染毒组给予10 mg/kg NaAsO_(2)灌胃;TAK-242干预组给予10 mg/kg NaAsO_(2)灌胃,12周后同时给予0.5 mg/kg TLR4抑制剂TAK-242腹腔注射。每周给药6 d,持续36周。实验结束后采集各组大鼠肝组织和血清,HE、Masson染色法光镜下观察肝组织病理学及胶原纤维沉积情况;全自动生化分析仪检测血清肝功能指标丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)含量;蛋白质印迹法检测大鼠肝组织纤维化蛋白α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、转化生长因子-β1(TGF-β1)、波形蛋白(Vimentin)表达水平及TLR4信号通路相关蛋白TLR4,核转录因子κB(NF-κB)-p65亚基(p65)、NF-κB-p50亚基(p50)及其磷酸化蛋白p-p65、p-p50表达水平;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测肝组织炎症因子白细胞介素(IL)-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-10分泌水平。结果HE、Masson染色结果显示,与对照组比较,NaAsO_(2)染毒组出现明显的炎性细胞浸润、肝细胞坏死及胶原纤维沉积,而TAK-242干预组炎性细胞浸润情况较NaAsO_(2)染毒组有所改善,并且胶原纤维沉积减少。血清肝功能指标ALT、AST、ALP含量检测结果显示,NaAsO_(2)染毒组均高于对照组,而TAK-242干预组均低于NaAsO_(2)染毒组(均P<0.05)。蛋白质印迹法检测结果显示,NaAsO_(2)染毒组大鼠肝组织纤维化蛋白α-SMA、TGF-β1、Vimentin(1.04±0.19、0.92±0.14、1.20±0.21),TLR4信号通路相关蛋白及其磷酸化蛋白TLR4、p50、p-p50、p-p65表达水平(1.16±0.21、0.95±0.16、1.24±0.23、1.56±0.25)均高于对照组(0.44±0.08、0.42±0.08、0.72±0.07,0.69±0.15、0.71±0.11、0.46±0.07、0.54±0.11,均P<0.05),TAK-242干预组(0.60±0.13、0.59±0.16、0.49±0.11,0.47±0.08、0.86±0.09、0.79±0.14、1.02±0.17)表达水平均低于NaAsO_(2)染毒组(均P<0.05);p65表达水平3组间比较,差异无统计学意义(F=14.29,P=0.053)。ELISA检测结果显示,NaAsO_(2)染毒组大鼠肝组织IL-6、TNF-α分泌水平[(98.89±4.58)、(83.25±4.57)ng/g]均高于对照组[(27.30±3.92)、(27.77±1.83)ng/g,均P<0.05],而IL-10分泌水平[(36.88±3.86)ng/g]低于对照组[(77.96±7.87)ng/g,P<0.05];TAK-242干预组与NaAsO_(2)染毒组比较,IL-6、TNF-α分泌水平[(44.32±3.60)、(36.51±2.93)ng/g]均较低,IL-10分泌水平[(60.40±4.94)ng/g]较高(均P<0.05)。结论TLR4介导的炎症信号通路相关蛋白及其磷酸化蛋白在无机砷暴露大鼠肝组织中均高表达,抑制TLR4信号通路可明显减轻无机砷致大鼠肝纤维化损伤程度。