黄腐酚对内皮祖细胞增殖、迁移、成管及凋亡的影响及机制

背景:肿瘤的发展依赖于血管新生,以输送氧气和微量营养素,并促使其转移,而肿瘤中的新生血管被认为是由原有血管系统中内皮细胞迁移和增殖形成新的毛细血管。越来越多的证据表明,骨髓源性内皮祖细胞有助于新血管形成,并已成为抗肿瘤治疗的重要靶点。在之前的研究中,未有黄腐酚对骨髓来源内皮祖细胞作用的相关报道。目的:探讨黄腐酚对骨髓源性内皮祖细胞增殖、迁移、成管以及凋亡的影响,并初步探讨其作用机制。方法:第3代小鼠骨髓内皮祖细胞分为4组:5,10,20μmol/L黄腐酚组,以等量二甲基亚砜溶解液为对照组。干预24,48 h,通过CCK-8法测定黄腐酚对小鼠骨髓内皮祖细胞增殖的影响;干预24 h,划痕实验、Transwell实验检测黄腐酚对小鼠骨髓内皮祖细胞迁移的影响;干预6 h,成管实验检测黄腐酚对小鼠骨髓内皮祖细胞管腔形成的影响;干预48 h,流式细胞术、TUNEL凋亡染色法检测黄腐酚对小鼠骨髓内皮祖细胞凋亡的影响;干预48 h,Western blot法检测黄腐酚对小鼠骨髓内皮祖细胞中血管内皮生长因子、血管内皮生长因子受体2、P65、p-P65蛋白表达的影响。结果与结论:①黄腐酚干预后,骨髓内皮祖细胞在24,48 h生长半数抑制浓度(IC50)分别为(22.19±0.98),(11.51±1.25)μmol/L,差异有显著性意义(P<0.05),表明黄腐酚可明显抑制骨髓内皮祖细胞的增殖,且具有一定的剂量效应关系(P<0.05);②与对照组相比,随着黄腐酚浓度的增大,划痕越明显(P<0.05),迁移细胞数逐渐减少(P<0.05);③对照组有大量小管样结构形成,而5,10μmol/L黄腐酚组小管样结构明显减少,20μmol/L黄腐酚组基本无小管样结构形成,与对照组相比,差异有显著性意义(P<0.05);④细胞凋亡率随着黄腐酚浓度升高而上升,具有浓度依赖性,且黄腐酚各组凋亡率均高于对照组(P<0.05);⑤与对照组相比,随着黄腐酚浓度的增大,p-P65、血管内皮生长因子表达下降,而血管内皮生长因子受体2呈反馈性升高,具有浓度依赖性(P<0.05);⑤结果表明,黄腐酚可抑制骨髓源性内皮祖细胞的增殖、迁移、成管并同时促进其凋亡,其机制可能是通过抑制NF-κB/血管内皮生长因子信号通路,表明黄腐酚具有抗肿瘤血管生成的潜能。

黄腐酚对小鼠肝多房棘球蚴生长的抑制作用

目的探讨黄腐酚对小鼠肝多房棘球蚴生长的抑制作用。方法将30只肝脏感染多房棘球蚴后30 d的C57BL/6小鼠随机分为感染组、溶剂组、黄腐酚组,每组10只;另设健康对照组(10只)。黄腐酚组每周经腹腔注射黄腐酚10 mg/kg,溶剂组腹腔注射等体积二甲基亚砜(DMSO),健康对照组和感染组不作任何处理。治疗60 d后安乐处死各组小鼠,称量各组小鼠肝湿重和多房棘球蚴囊湿重,计算囊湿重抑囊率。ELISA检测各组小鼠血清中血管内皮生长因子(VEGF)的含量。制备肝病理组织切片,苏木精-伊红染色法(HE)观察肝多房棘球蚴组织病理学改变,免疫组化法和蛋白质免疫印迹(Western blotting)检测小鼠肝多房棘球蚴组织中核因子κB P65(NF-κB P65)、VEGF和微血管密度-高度糖基化的I型跨膜蛋白(MVD-CD34)的蛋白表达水平,以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参。结果黄腐酚治疗60 d后,黄腐酚组小鼠囊湿重为(0.458±0.068)g,低于感染组的(1.088±0.274)g和溶剂组的(1.973±0.213)g(均P<0.05);黄腐酚组囊抑制率为57.7%(63/109),高于溶剂组的10.4%(11.5/109.8)和感染组的0(均P<0.05)。ELISA检测结果显示,黄腐酚组小鼠血清中VEGF为(45.24±1.93)pg/ml,低于感染组的(58.00±5.56)pg/ml和溶剂组的(57.85±16.00)pg/ml,高于健康对照组的(40.20±3.24)pg/ml(均P<0.05)。小鼠肝多房棘球蚴病灶组织病理学检查结果示,黄腐酚组炎性反应带窄,生发层紊乱。免疫组化检测结果示:黄腐酚组小鼠肝多房棘球蚴组织中NF-κB P65的评分为(2.65±1.14),低于感染组的(9.46±2.60)和溶剂组的(9.20±1.64)(均P<0.05);黄腐酚组VEGF的评分为(1.80±0.83),低于感染组(7.20±1.30)和溶剂组的(7.43±2.96)(均P<0.05);黄腐酚组MVD-CD34的评分为(16.40±1.14),低于感染组的(40.60±1.14)和溶剂组的(40.83±2.16)(均P<0.05)。Western blotting检测结果显示,黄腐酚组小鼠肝多房棘球蚴组织中VEGF/GAPDH比值为(0.76±0.82),低于感染组的(2.84±0.33)和溶剂组的(2.47±0.12),高于健康对照组的(0.63±0.02)(均P<0.05),而感染组与溶剂组相比差异无统计学意义(P>0.05);黄腐酚组中MVD-CD34/GAPDH比值为(0.40±0.02),低于感染组的(1.11±0.07)和溶剂组的(1.02±0.14),高于健康对照组的(0.14±0.02)(均P<0.05),感染组与溶剂组差异无统计学意义(P>0.05);黄腐酚组中NF-κB P65/GAPDH比值为(0.24±0.03),低于感染组的(0.61±0.05)和溶剂组的(0.66±0.13),高于健康对照组的(0.02±0.01)(均P<0.05)。结论黄腐酚治疗肝多房棘球蚴感染小鼠60 d后,对肝多房棘球蚴的生长和血管生成有一定的抑制作用。

黄腐酚对体外泡状棘球蚴原头节活性的影响

目的探讨不同浓度黄腐酚在体外对泡状棘球蚴原头节活性及形态学影响。方法将体外培养的泡状棘球蚴原头节随机分为6组:空白对照组,溶剂对照组和黄腐酚10、20、40、80μmol/L组,培养7 d,每24 h用0.1%伊红染色后在倒置显微镜下观察原头节的活性并计算成活率;黄腐酚作用泡状棘球蚴原头节3 d后,应用半胱天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)检测试剂盒检测caspase-3活性;Western blot检测体外培养3d后的原头节Bcl-2、Bax蛋白表达量;使用活性氧检测试剂盒检测体外作用24 h后6组原头节内活性氧(ROS)变化水平。结果随着药物浓度升高,泡状棘球蚴原头节活力降低,空白对照组、溶剂对照组泡状棘球蚴原头节在第7 d的活力分别为(97.26±0.208)%、(97.33±0.305)%,第7 d 10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L黄腐酚组泡状棘球蚴原头节的活力分别为(42.06±0.404)%、(24.10±0.200)%、(11.83±0.416)%,均低于对照组(P均<0.05)。80μmol/L黄腐酚组杀伤作用较强,原头蚴的活力为(0.96±0.208)%。不同浓度黄腐酚组作用原头蚴3 d,caspase-3活性与对照组相比显著增高(P<0.05)。黄腐酚不同浓度作用原头蚴3 d后,凋亡抑制蛋白Bcl-2表达下降,而凋亡蛋白Bax表达随着药物浓度的增加而显著上调(P<0.05)。不同浓度黄腐酚作用24 h后原头节体内活性氧(ROS)水平与对照组相比显著升高(P<0.05)。结论黄腐酚在体外具有一定杀灭泡球蚴原头节作用,并表现出时间依赖性和浓度依赖性。其机制可能与caspase-3活性增强、Bax表达水平升高、Bcl-2表达水平降低、ROS水平增高诱导头节细胞的凋亡有关。