钝齿棒杆菌乳酸脱氢酶基因敲除菌株的构建

目的钝齿棒杆菌厌氧发酵时,其主要代谢产物为琥珀酸和乳酸。敲除乳酸脱氢酶基因(LdhA)可以减少乳酸的生成,提高钝齿棒杆菌产琥珀酸代谢途径的通量。方法为获得乳酸脱氢酶基因缺失的钝齿棒杆菌突变株,先通过PCR扩增获得LdhA基因的上、下游同源重组臂及卡那霉素抗性基因(Kn),然后通过融合PCR技术将LdhA基因上、下游同源重组臂与Kn抗性基因连接构建打靶片断与打靶质粒。结果先后成功构建了打靶片段ΔLdhA::Kn、打靶质质粒pCVD442-ΔLdhA::Kn与供体菌株E.coliβ2155/pCVD442-ΔLdhA::Kn,并成功筛选到具有卡那霉素抗性的钝齿棒杆菌单克隆菌株。结论PCR鉴定与乳酸脱氢酶活力分析结果表明,钝齿棒杆菌基因组中LdhA基因被Kn抗性基因替换,LdhA基因敲除成功,为后续利用钝齿棒杆菌高产琥珀酸奠定了基础。