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哈茨木霉几丁质酶cDNA基因的克隆及在酿酒酵母中的表达 被引量:4
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作者 刘丕钢 杨谦 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第2期253-257,共5页
为研究哈茨木霉 (Trichodermaharzianum)的生物防治机制并获得与生物防治相关基因 ,通过构建哈茨木霉菌丝生长期的cDNA文库及对部分表达序列标签序列的测定与生物信息学分析 ,成功获得了哈茨木霉几丁质酶v(ChiV)基因的全长cDNA序列。该... 为研究哈茨木霉 (Trichodermaharzianum)的生物防治机制并获得与生物防治相关基因 ,通过构建哈茨木霉菌丝生长期的cDNA文库及对部分表达序列标签序列的测定与生物信息学分析 ,成功获得了哈茨木霉几丁质酶v(ChiV)基因的全长cDNA序列。该基因的编码框长度为 1194bp ,编码 397个氨基酸 ,理论分子量为 4 4kD。将该基因构建到酿酒酵母诱导型表达载体pYES2上 ,转化到酿酒酵母H15 8菌株中 ,通过Northern杂交检验后 ,确定该基因在酿酒酵母转录水平上表达。在 β_半乳糖诱导下 ,转化子在培养 6 0h时产生的酶活活性最高 ,几丁质酶V最适活性温度为 37℃ ,在pH 6和pH 8时活性较高。 展开更多
关键词 哈茨木霉 几丁质酶 表达
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哈茨木霉cDNA文库构建及表达序列标签分析 被引量:2
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作者 刘丕钢 杨谦 《哈尔滨工业大学学报》 EI CAS CSCD 北大核心 2005年第11期1503-1506,1548,共5页
为了从分子水平上研究哈茨木霉的生物防治作用机制,构建了哈茨木霉菌丝体时期的cDNA文库并随机挑选部分克隆进行了测序分析.所构建的文库滴度为1.2×106pfu/m l,重组率为93%,插入片断平均长度>1.2 kb.对随机挑选的305条ESTs测序... 为了从分子水平上研究哈茨木霉的生物防治作用机制,构建了哈茨木霉菌丝体时期的cDNA文库并随机挑选部分克隆进行了测序分析.所构建的文库滴度为1.2×106pfu/m l,重组率为93%,插入片断平均长度>1.2 kb.对随机挑选的305条ESTs测序分析,其中67条EST为已知基因,58条为已知EST,其余的180条为新EST.在已知基因中,有9条ESTs与生物防治相关.从对文库的初步检验结果看,文库具有良好的质量,符合大规模测序的标准.通过ESTs研究是获得功能基因的有效手段. 展开更多
关键词 哈茨木霉 CDNA文库 表达序列标签(EST) 生物防治
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哈茨木霉UBc基因的克隆及表达
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作者 刘丕钢 杨谦 赵云飞 《哈尔滨工业大学学报》 EI CAS CSCD 北大核心 2008年第9期1426-1430,共5页
筛选哈茨木霉的cDNA文库,克隆到泛素结合酶基因的cDNA全长序列,并对其进行生物信息学分析,该序列的长度为951 bp,包含一个455 bp的完整开放阅读框,编码157个氨基酸,其理论分子量为17.64ku.在氨基酸水平上,具有较高的保守性.以克隆载体pB... 筛选哈茨木霉的cDNA文库,克隆到泛素结合酶基因的cDNA全长序列,并对其进行生物信息学分析,该序列的长度为951 bp,包含一个455 bp的完整开放阅读框,编码157个氨基酸,其理论分子量为17.64ku.在氨基酸水平上,具有较高的保守性.以克隆载体pBK5313为模板,设计含有XhoI和BamH I酶切位点的引物,成功地获得包含完整阅读框的目的基因;将目的基因连接到表达载体pET28上,构建出含有泛素结合酶基因的重组子pET28-UBc,转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株中,成功地获得了大量的大肠杆菌转化子.通过对大肠杆菌转化子菌落PCR检验、质粒双酶切鉴定及测序分析,证实了成功转化.通过IPTG诱导,优化了泛素结合酶原核表达的条件,最佳诱导时间为4 h,诱导剂浓度对蛋白表达量影响不大.本研究为进一步研究哈茨木霉的生物防治作用机制,诠释蛋白质代谢途径提供基本技术支持. 展开更多
关键词 哈茨木霉 UBc基因 原核表达 优化
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哈茨木霉Chiv基因的原核表达及优化
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作者 刘丕钢 杨谦 王奇慧 《哈尔滨工业大学学报》 EI CAS CSCD 北大核心 2008年第8期1252-1255,共4页
通过筛选哈茨木霉的DNA文库,克隆到Chiv基因的cDNA全长序列.以连接有哈茨木霉Chiv基因的质粒pBK902为模板,设计含有EcoRI和XhoI酶切位点引物,采用PCR方法扩增得到具有完整开放阅读框的目的基因;将目的基因连接到表达载体pET28上并转化... 通过筛选哈茨木霉的DNA文库,克隆到Chiv基因的cDNA全长序列.以连接有哈茨木霉Chiv基因的质粒pBK902为模板,设计含有EcoRI和XhoI酶切位点引物,采用PCR方法扩增得到具有完整开放阅读框的目的基因;将目的基因连接到表达载体pET28上并转化大肠杆菌BL21菌株中,成功地获得了大量的阳性转化子.质粒通过EcoRI和XhoI酶切鉴定及测序鉴定,证明Chiv基因成功地转化到大肠杆菌中.重组大肠杆菌经IPTG诱导表达及SDS-PAGE检测后,发现特异的蛋白表达条带,其分子量为50 kDa左右.通过对诱导剂量与诱导时间等因素的优化,结果显示几丁质酶的最佳诱导时间为13 h,最佳诱导剂浓度为1 mM,为几丁质酶的工业化生产奠定基础. 展开更多
关键词 哈茨木霉 几丁质酶v基因 原核表达 优化
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哈茨木霉超氧化物歧化酶基因克隆与特性分析 被引量:1
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作者 杨力明 杨谦 +2 位作者 刘丕钢 王菁华 李森 《生物信息学》 2007年第4期148-150,154,共4页
构建了哈茨木霉菌丝的cDNA文库,并获得了3298条ESTs序列,对哈茨木霉(Trichoderma harzianum)ESTs序列本地数据库进行tBlastn检索,获得了哈茨木霉超氧化物歧化酶cDNA序列。cDNA序列全长751 bp,开放阅读框465bp,编码154个氨基酸组成的多肽... 构建了哈茨木霉菌丝的cDNA文库,并获得了3298条ESTs序列,对哈茨木霉(Trichoderma harzianum)ESTs序列本地数据库进行tBlastn检索,获得了哈茨木霉超氧化物歧化酶cDNA序列。cDNA序列全长751 bp,开放阅读框465bp,编码154个氨基酸组成的多肽,蛋白分子量为15.7kD。BlastP同源性分析表明该基因与麦角真菌(Claviceps purpurea)相似性最高为86%;与解脂耶氏酵母菌(Yarrowia lipolytica)相似性最低为72%。三级结构预测表明,其活性中心可能与His47,His49,His64,His72,His81,His121,D84位点有关,并构成其活性中心骨架。 展开更多
关键词 哈茨木霉 超氧化物歧化酶 基因克隆 特性分析
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