乳腺癌细胞高亲和融合多肽蛋白的表达以及靶向转运

目的探究乳腺癌特异性多肽携带外源生物分子进入特定肿瘤细胞的功能。方法编码乳腺癌细胞特异性多肽(PⅠ)的序列插入质粒pGEX-2T,构建原核表达载体pGEX-2T-PⅠ,表达融合蛋白GST-PⅠ,亲和层析纯化,Western-blot鉴定。GST-PⅠ与人乳腺癌细胞MBA-MB-231体外共培养,免疫荧光检测PⅠ多肽携带GST蛋白的跨膜功能。结果成功构建pGEX-2T-PⅠ原核表达载体,并在大肠杆菌中表达。融合蛋白占细菌总蛋白量的30%左右,纯化后蛋白纯度约为85%。免疫荧光检测显示,GST-PⅠ能特异性进入MDA-MB-231细胞。结论乳腺癌特异性多肽PⅠ能够介导融合蛋白GST-PⅠ穿过细胞膜进入MDA-MB-231细胞内。

HSV-TK+GFP/GCV自杀基因系统对小鼠胰腺癌的治疗作用

目的:探讨HSV-TK+GFP/GCV自杀基因系统对小鼠胰腺癌细胞系MPC体外及体内杀伤作用及其产生的旁观者效应.方法:通过RT-PCR从基因组文库中扩增出HSV-TK基因全长CDS序列,并将其与GFP基因定向克隆到质粒表达载体pcDNA3.1(+),构建重组质粒pcDNA3.1+/HSV-TK+GFP.脂质体法将重组质粒转染小鼠胰腺癌细胞株MPC细胞,得到带有HSV-TK和GFP基因的MPC/HSV-TK+GFP细胞,并将其分别用于体外和体内实验.结果:重组质粒pcDNA3.1+/HSV-TK+GFP导入小鼠胰腺癌细胞株MPC细胞.体外实验结果显示,当MPC/HSV-TK+GFP细胞数占混合细胞10%时,低浓度(20mg/L)的GCV就可将50%左右的肿瘤细胞杀死.体内实验结果显示GCV可明显抑制MPC/HSV-TK+GFP细胞在昆明小鼠体内的肿瘤形成.结论:HSV-TK和GFP基因转入小鼠胰腺癌细胞株MPC细胞并获得稳定表达,HSV-TK+GFP/GCV自杀基因系统在体内外对小鼠胰腺癌均有杀伤作用,且存在明显的旁观者效应.

腹腔镜手术系统在腹部肿瘤外科临床教学中的应用和体会

腹腔镜手术系统教学有直观、形象、现实感染力强等特点,易于激发学生的学习兴趣,节省教学时间,可提高教学质量,增强教学效果。目前,腹腔镜手术已经在全国大中型医院普遍开展,腹腔镜外科教学在临床教学的地位也显得更为重要,随着住院医师规范化培训在国内的开展,腹腔镜技术的推广及掌握对于培训临床高层次医师、提高医疗质量极为重要。因此,提高腹腔镜技术在医学生教学中的地位,让医学生及青年医师掌握基本的微创外科技术,这对未来的医学发展具有重要意义。

乳腺癌特异性多肽介导的HSV-TK/GCV系统的构建及其靶向杀伤效应

目的:研究乳腺癌MDA-MB-231细胞特异性转导多肽PI介导的HSV-TK/GCV抗瘤系统对乳腺癌MDA-MB-231细胞的体外靶向杀伤作用。方法:以PCR从质粒pORF-HSV-TK中扩增目的基因PI-TK,克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,构建pET-28a(+)-PI-TK载体,转化宿主菌,经IPTG诱导表达PI-TK融合蛋白,利用His-Tag对其进行纯化,SDS-PAGE和Western blotting鉴定PI-TK融合蛋白。将不同质量浓度的PI-TK融合蛋白与MDA-MB-231细胞共培养,联合更昔洛韦(ganci-clovier,GCV)作用后,倒置显微镜下观察细胞的形态变化,CCK-8法检测MDA-MB-231细胞的增殖。结果:成功构建了重组原核表达载体pET-28a(+)-PI-TK,获得纯化的PI-TK融合蛋白,SDS-PAGE及Western blotting鉴定PI-TK融合蛋白表达正确。单独PI-TK融合蛋白不影响MDA-MB-231细胞的形态和增殖,但PI-TK融合蛋白联合GCV能剂量依赖性靶向抑制MDA-MB-231细胞的增殖,200μg/ml PI-TK+10 mg/LGCV作用的抑制率达(68.9±7.57)%;PI-TK联合GCV抑制MDA-MB-231细胞的IC50值为152.64μg/ml。上述各作用对MDA-MB-435细胞均无影响(P<0.05)。结论:乳腺癌特异性转导多肽PI介导的HSV-TK/GCV抗瘤系统可靶向杀伤MDA-MB-231细胞。

BALB/c小鼠结肠癌肝转移模型建立

目的建立BALB/c小鼠结肠癌肝转移模型。方法以BALB/c小鼠为对象,随机分为3组,分别经腹腔脾脏内(分为保脾组和切脾组)、直肠粘膜内注射小鼠结肠癌CT-26细胞0.2ml(浓度为1×107 ml),观察小鼠平均生存期、成瘤情况、肝转移率、肝脏转移肿瘤大小和其他脏器的转移情况。结果这3种方法均能建立大肠癌肝转移模型,切脾组小鼠平均生存期为(28±5)d,肝转移率为100%,均有肺、胃、膈肌转移及腹水形成,保脾组小鼠平均生存期为(30±5)d,肝转移率为95%,均有肺、胃、膈肌转移及腹水形成;直肠黏膜内注射组小鼠平均生存期为(20±5)d,肝转移率为30%,无肺、胃、膈肌转移及腹水形成。结论保脾组和切脾组比直肠黏膜注射组的成瘤率、转移率更高,小鼠平均生存期较长,同时也增加了其他脏器的肿瘤转移率,建模更稳定,观察期能更好地完成各项指标的评价。

APC、MYH及AXIN2基因突变检测在家族性腺瘤性息肉病胚系突变筛查中的应用

目的:通过对本实验室中已收集的云南省遗传性大肠癌标本库中的家族性腺瘤性息肉病(familial adenomatous polyposis,F A P)家系标本进行F A P常见致突变基因APC(adenomatous polyposis coli)基因的筛查,对APC基因筛查为阴性的标本则进一步行MYH(Mut Y Homologue)基因及轴抑制蛋白(axis inhibition protein 2,AXIN2)基因检测,探讨FAP家系患者的致病基因及其突变位点.方法:利用已建立的云南省遗传性大肠癌标本库中家系标本进行DNA的提取,PCR特异性扩增APC基因所有外显子和启动子区域,分析APC基因及其启动子是否存在点突变;对于APC基因筛查未见突变者,继续行MYH和AXIN2基因全外显子检测.结果:在所选的5个FAP家系成员的DNA中,1个家系中的1例患者检测出A P C基因新的突变(100025_100028het_dup AGAA),其余4个家系患者未检测到APC基因致病性突变;而对于APC基因突变阴性者进行的MYH基因突变筛查中,其中一个家系中的1例患者发现了新的突变(11198_11200het_del TGT);而在AXIN2基因检测中,检出4个同义突变,其中,同义突变c.2062C>T(p.L688L)为已报道的致病性突变.结论:相较于国内外同类研究报道,云南省FAP家系成员APC基因突变检出率较低,针对MYH及AXIN2基因检测同时也应作为FAP致病基因筛查的靶点.

乳腺癌特异性转导小肽融合表达载体的构建以及目的蛋白的表达

目的构建乳腺癌特异性转导小肽PI-增强型绿色荧光蛋白融合蛋白的原核表达载体,并进行目的蛋白的表达、分离和纯化。方法合成PI的DNA序列,将其定向插入到p EGFPN2中,经双酶切获取PI-EGFP的核苷酸序列,再将其克隆入原核表达质粒pET-28a(+),构建出pET-28a(+)-PI-EGFP的原核表达载体;重组质粒转化BL21(DE3)pLysS感受态细胞,经IPTG诱导表达,利用His-tag对蛋白进行分离纯化,SDS-PAGE电泳和蛋白质印迹免疫分析(Western blot)鉴定纯化蛋白质。结果成功构建了pET-28a(+)-PI-EGFP的原核表达载体;其经诱导后,在大肠杆菌中高效表达,目的蛋白以可溶性形式存在;SDS-PAGE分析显示,在相对分子量约33kD的位置出现目的蛋白条带,与理论值相符;经His TALONTM Cartridge亲和层析纯化获得了高纯度的重组的PI-EGFP融合蛋白,Western blot鉴定结果显示获得了目的蛋白。结论成功构建出乳腺癌特异性转导小肽PI-增强型绿色荧光蛋白融合蛋白原核表达载体,并能够表达出PI-EGFP的融合蛋白,为进一步研究小肽的乳腺癌特异性转导功能奠定基础。

体细胞治疗在肿瘤生物治疗中的意义和作用

随着肿瘤生物治疗技术的发展,生物治疗已经成为继手术、放疗、化疗之后的第四种治疗方式,在肿瘤综合治疗中占有重要地位,其中体细胞治疗作为生物治疗中的重要技术与多种治疗手段相结合形成了多元化的治疗形式。本文就国内外体细胞治疗的发展及其与化疗、微创介入、肿瘤靶向药物结合的研究和应用现状做一评述。

道路交通事故颌面部损伤特征的法医临床学分析

目的:研究道路交通事故颌面部损伤的法医临床学损伤特征,分析颌面部损伤的伤残评定特点,为法医学鉴定实践提供参考。方法:对昆明医科大学司法鉴定中心鉴定的2013年和2014年昆明地区道路交通事故颌面部损伤154例伤残评定案例进行分析研究。结果:本组154例道路交通事故颌面部损伤的案例中,构成伤残89例(57.8%),最高等级Ⅴ级,总体分布以Ⅸ级、Ⅹ级轻度伤残为主。损伤特征主要为瘢痕及色素沉着,其次为牙齿脱落。结论:道路交通事故受伤人群致伤致残率高,伤残程度以轻度伤残为主。

多学科协作诊疗模式在肿瘤科实习医生培养中的作用

现阶段我国大型综合性医院专科或亚专科的划分,导致专业细化,不仅使不同专科之间产生了技术隔离,专科医师之间产生职业偏见,还使专科教育出来的医学生临床思维局限且狭隘,与快速发展的现代医学不协调,严重影响了医学人才梯队培养。如今传统医学模式已经发生了根本性变化。由于医学专科或亚专科的划分越来越细,病人常需要一次到几个专科诊治;专科医师在某种单一学科中长期工作与学习,往往习惯于单纯从本专业角度思考或处理临床问题。

人乳腺癌细胞特异性多肽跨膜转导机制初步研究

目的:初步探讨人乳腺癌细胞MDA-MB-231特异性多肽PI的跨膜转导机制。方法:合成PI肽链,并在其N端进行FITC标记;探讨FITC-PI的跨膜转导与MHC-Ⅰ表达的关系,利用MHC-Ⅰ抗体阻断MDA-MB-231细胞和Calu-1细胞表面MHC-Ⅰ抗原,聚合酶链反应-序列特异性引物法进行基因分析;探讨FITC-PI的跨膜转导是否与小窝蛋白介导的内吞有关,抑制剂制霉菌素与MDA-MB-231细胞共培养,荧光显微镜观察以及流式细胞仪检测细胞内FITC-PI分布情况;探讨FITC-PI跨膜转导是否与2株细胞表面相同的膜蛋白有关系,膜蛋白提取试剂盒分别提取2株细胞膜蛋白,双向电泳对其进行差异性分析。结果:MHC-Ⅰ抗体阻断后,2株细胞内仍可见FITC-PI分布,基因位点分析显示2株细胞HLA-A、B位点等位基因不同;加入制霉菌素后,镜下观察及流式细胞仪检测均显示FITC-PI分布减少;双向电泳初步分析2株细胞膜蛋白图谱共有11个相同的蛋白点。结论:PI的跨膜转导机制不单一,其一,部分由小窝蛋白介导的内吞机制,其二,可能与2株细胞表面相同的膜蛋白有关系,此研究为将来继续探讨其跨膜转导机制奠定了实验基础和理论依据。

人乳腺癌组织中miR-34a的表达及其在乳腺癌细胞系中的功能研究

目的探讨miR-34a在人乳腺癌组织和细胞中的表达情况及对乳腺癌细胞系MDA-MB-231增殖、迁移侵袭和凋亡等生物学行为的影响,为研究乳腺癌组织中miR-34a的作用及深入了解乳腺癌发生发展的分子机制奠定理论基础。方法通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测miR-34a在20例人乳腺癌组织和癌旁正常组织中表达量的差异并比较其在人乳腺癌细胞系MDA-MB-231、MCF-7和正常乳腺上皮细胞MCF-10A中的表达差异;体外利用脂质体转染技术,转染miR-34a的模拟物(miR-34a mimic)和标记FAM(绿色荧光)的阴性对照(negative control,miR-NC)进入MDA-MB-231细胞,研究miR-34a对细胞增殖活性、迁移和侵袭能力以及凋亡和周期分布的影响。结果 miR-34a在乳腺癌组织中的表达量较正常癌旁组织下调(P<0.01);在MDA-MB-231、MCF-7和MCF-10A中的表达呈依次增高的趋势(P<0.01);转染miR-34a mimic与转染miR-NC的MDA-MB-231相比,其增殖活力、迁移和侵袭能力均下降(P<0.01),凋亡增加(P<0.01),细胞周期被阻滞在G1/G0期(P<0.01)。结论 miR-34a在乳腺癌组织和细胞系MDA-MB-231及MCF-7中的表达较正常组织和MCF-10A中都明显下调;miR-34a能够抑制肿瘤细胞MDA-MB-231的增殖、侵袭迁移,增加细胞凋亡率,使细胞周期阻滞在G0/G1;miR-34a可能起到抑癌作用,其表达水平与乳腺癌的发生发展密切相关。

多肽修饰载紫杉醇PLGA微球的制备技术

目的 以乳酸-羟基乙酸共聚物[poly（lactic-co-glycolic acid）,PLGA]为载体,研究经三阴性乳腺癌特异性多肽修饰的载紫杉醇PLGA微球（PI-PTX/PLGA微球）的构建方法,建立新型的经多肽修饰的载药方式。方法 以乳化-溶剂挥发法制备包载紫杉醇的PLGA微球（PTX/PLGA微球）,采用EDC/NHS体系作为交联剂,将PI多肽连于PTX/PLGA微球表面,通过扫描电镜、激光粒度仪、高效液相色谱仪和倒置荧光显微镜分析微球的表面形态、粒径、载药量、包封率及多肽连接状态。结果 多肽修饰的载药微球呈圆球形,分散性好,形态规整,无聚集现象,球体表面未见明显空隙,激光粒度仪测得空白PLGA微球、PTX/PLGA微球和PI-PTX/PLGA微球的平均粒径分别为14.65μm、15.07μm和17.15μm。高效液相色谱法测得紫杉醇在1.0~50μg/ml浓度范围内,峰面积（Y）对紫杉醇浓度（X）有良好的线性关系,得到标准曲线方程为Y=33.783X＋2.7098（R2=1）,由此计算PTX/PLGA微球和PI-PTX/PLGA微球的载药量和包封率分别为2.8%和91%、2.5%和84%。多肽修饰的载药微球,表面呈绿色荧光,EDC/NHS交联体系对微球结构无明显影响。结论 EDC/NHS交联体系适用于多肽与PLGA微球的连接,稳定性好。同时,也为靶向生物分子与载药微球的结合提供了新的途径。

miR-34a对肿瘤发生发展调控作用的最近研究进展

真核生物基因组中超过97％的转录产物是不编码蛋白质的RNA，miRNA作为其中的一类非编码的单链小分子RNA，长约20～25个核苷酸，通过与其靶基因mRNA完全或部分互补结合在转录后水平发挥广泛的调节作用，包括生长发育、病毒防御、造血、

利用生物信息学技术分析APC基因同义突变SNP在家族性腺瘤性息肉病发病机制的研究

目的利用生物信息学技术分析APC基因同义突变SNP(sSNP)在家族性腺瘤性息肉病(FAP)中的发病机制。方法选取云南省遗传性大肠癌组织标本库中的5个FAP患者的组织标本进行APC基因突变比对分析,将筛选得到的sSNP进行生物信息学预测,包括蛋白编码、剪接调节、转录调节、翻译后调节,并对RNA二级结构影响分析方面的预测。结果筛选得到5个可能对APC蛋白产生影响的sSNP,生物信息学预测提示这些sSNP在mRNA水平影响剪接增强子(ESE)从而引起APC外显子异常剪切,使APC蛋白截短而导致FAP。RNA二级结构分析发现这些sSNP对RNA稳定、与其他RNA或蛋白的相互作用等产生功能性影响。结论利用生物信息学预测手段,APC基因的某些sSNP引起的突变效应可以解释部分APC阴性FAP的病因。

乳腺癌细胞靶向特异性多肽研究

通过噬菌体肽库技术,研究能特异性结合并具有携带目的基因进入靶细胞能力的多肽.以人乳腺癌细胞MDA-MB-231为靶细胞,与pC89噬菌体肽库共培养筛选出能特异性进入靶细胞的小肽噬菌体.Subtilisin被用于灭活未进入细胞的噬菌体,进入细胞的特异性小肽噬菌体经细胞裂解、转化E.coliXLI-Blue得到扩增.经5轮反复共培养,富集得到能特异性进入乳腺癌细胞的小肽噬菌体.以RGD-integrin binding噬菌体为对照,分别检测乳腺癌细胞特异性小肽噬菌体与MDA-MB-231、其他乳腺癌细胞株以及实体瘤细胞株的亲和性.测序并合成无噬菌体外壳蛋白的特异性多肽(CASPSGALRSC)以标记FITC;同时为了解氨基酸序列排列对特异性的影响,合成了调整氨基酸序列排列次序的多肽(CGSLSRAPSAC),并检测其与人乳腺癌细胞的特异性.实验获得与MDA-MB-231细胞特异性结合的小肽噬菌体;合成的无噬菌体外壳蛋白的多肽序列保持与MDA-MB-231细胞的特异性,并且亲和性高于嵌合蛋白(RGD-integrin).本研究建立了一种利用噬菌体肽库研究能结合或进入不同细胞的未知多肽的技术;得到了一条能与MDA-MB-231高特异性结合的氨基酸多肽序列;这种高特异性呈现氨基酸多肽序列高度依赖性;该氨基酸多肽具有作为乳腺癌基因治疗高效靶向性载体的潜在临床应用价值.

结肠癌细胞CDH1基因启动子甲基化对E-上皮钙黏素和β-连接素表达的调控作用

目的观察结肠癌细胞中上皮钙黏素基因（CDH1）启动子甲基化对上皮钙黏素（E—cadherin）和β-连接素（β—catenin）表达的影响。方法通过甲基化特异性PCR（MSP）、逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）检测DNA甲基化抑制剂5-氮-2′-脱氧胞苷（5-Aza-CdR）干预前后人结肠癌HT-29细胞株CDH1基因启动子甲基化状态及E—cadherin mRNA的改变，并运用免疫荧光标记及激光共聚焦观察E—cadherin和β-catenin在细胞内的表达及分布。结果（1）HT-29细胞在用药前CDH1基因启动子甲基化扩增阳性，非甲基化扩增阴性，用5-Aza-CdR处理后CDH1基因启动子甲基化扩增阴性，非甲基化扩增阳性；（2）5-Aza—CdR处理前细胞RT—PCR不能扩增出E—cadherin mRNA特异性条带，5-Aza—CdR处理后则可检测到E—cadherinmRNA转录，且mRNA水平与药物的浓度呈正相关，平均灰度比值1μmol／L时为0．491±0．011，2μmol／L时为0．568±0．013（P〈0．05：（3）5-Aza-CdR处理前细胞未见E-cadherin表达，13-catenin主要表达于细胞质及细胞核中，5-Aza—CdR处理后在细胞膜可见E—cadherin及-catenin表达。且随着5-Aza—CdR诱导E-cadherin的表达，β-catenin在细胞膜的分布增加，而在细胞质及细胞核的分布明显减少。免疫荧光双重染色显示β-catenin胞膜分布与E—cadherin一致。结论CDH1基因启动子甲基化可能是导致结肠癌细胞E—cadherin表达缺失及β—catenin异位分布的重要因素。

乳腺癌特异性多肽介导生物大分子体内外效应

探讨乳腺癌特异性多肽PI携带外源性生物大分子靶向抗肿瘤的作用.将分离纯化获得的融合蛋白PI-EGFP与靶细胞MDA-MB-231体外共培养,探讨融合蛋白与靶细胞的结合能力;将此融合蛋白经尾静脉及肿瘤局部注射入荷瘤裸鼠体内,探讨其在肿瘤部位的聚集程度;利用分子克隆技术构建重组原核表达载体pET-28a(+)-pI-tk,诱导表达、分离纯化、鉴定获得的融合蛋白PI-HSV-TK,将不同浓度的融合蛋白与MDA-MB-231细胞共培养,经更昔洛韦(ganciclovir,GCV)作用后,探讨PI-HSV-tk对细胞的靶向杀伤效应.荧光显微镜下观察,在靶细胞内可检测到绿色荧光信号,经尾静脉及局部注射融合蛋白PI-EGFP后,在不同组织器官可见不同强度的荧光信号,在尾静脉注射组的肾脏和肿瘤部位可检测到荧光信号,而局部注射组仅在肿瘤部位可检测到;成功构建了重组原核表达载体pET-28a(+)-pI-tk;分离纯化获得高效表达的PI-TK融合蛋白,SDS-PAGE电泳及Western blotting鉴定融合蛋白的表达正确;CCK-8法及流式细胞仪检测显示,GCV对转导融合蛋白的MDA-MB-231细胞有杀伤作用,IC50值为152.64μg/mL.乳腺癌特异性转导多肽能携带生物大分子进入靶细胞,并携带具有杀伤效应的物质,使其发挥靶向治疗作用,为进一步探讨该多肽作为靶向性载体奠定实验基础和理论依据.