探测应答调控蛋白PhoBNF20D自由态中存在的Pre-Active构象

PhoB是PhoR/PhoB双组分信号转导系统(TCS)中的应答调控蛋白,来自大肠杆菌,可以参与环境中自由Pi的调控应答.PhoB拥有保守的磷酸化位点D53,当Mg^2+存在时,会变成活性构象,但是其中的机理尚不清楚.目前已经有报道指出,自由态的应答调控蛋白存在少量的活性构象,而且它们和蛋白的激活过程相关,但是这种活性构象一般不稳定,很难观测到.本文以PhoBN^F20D作为模型,1H-15NHSQC和19F NMR谱图显示,自由态PhoBN^F20D在溶液中存在pre-active构象,BeF3^-可以稳定这种活性构象,而且Mg^2+可以促进非活性构象到活性构象之间的转化,在BeF3^-存在的情况下可以使PhoBN^F20D形成完全的活性构象.同时我们利用Carr-Purcell-Meiboom-Gill(CPMG)弛豫弥散实验证明了PhoBN^F20D存在两态交换.

细菌反应调节蛋白RR468磷酸化和去磷酸化关键位点的NMR研究

反应调节蛋白是细菌双组分信号转导系统的重要组分,用于传递来自组氨酸激酶的信号并产生适应性反应.在整个信号转导过程中,反应调节蛋白的磷酸化和去磷酸化最终决定了该系统的信号输出和信号转导终止,因此其磷酸化和去磷酸化作用位点是控制其功能的关键要素.我们以来源于Thermotoga maritima中的反应调节蛋白RR468作为研究对象,将其分别位于loopβ3-α3和loopβ4-α4上的两个关键位点M55和K85进行突变,通过功能实验验证了这两个残基突变会对蛋白磷酸化和去磷酸化产生影响,并且利用液体核磁共振(NMR)手段对两个突变体的结构和动力学性质进行了研究.

T69E模拟磷酸化修饰对Bcl-2与Nur77相互作用的影响

Bcl-2蛋白是Bcl-2家族中主要行使抗凋亡功能的蛋白质.核孤儿受体蛋白Nur77可出核定位至线粒体与其发生相互作用,促使Bcl-2的功能发生逆转,由细胞保护者转变为细胞杀手,从而促发细胞凋亡.Bcl-2的功能受翻译后修饰调控,如位于其BH3与BH4基序间无序loop区上T69位点的磷酸化.由于缺乏全长Bcl-2蛋白的结构信息,目前loop区T69的磷酸化修饰对两种蛋白相互作用的影响尚不清楚,缺乏原子水平的相关研究.因此,我们构建了含有loop区的胞内全长Bcl-2,并用T69E突变体模拟稳定的磷酸化修饰,综合运用圆二色谱(CD)、免疫印迹(Western Blot)、核磁共振(NMR)等技术手段对其相互作用进行研究.我们发现相比只含结构区的Bcl-2/xl嵌合体,胞内全长的Bcl-2和Nur77具有更强的相互作用,并且T69E模拟磷酸化修饰减弱了Bcl-2与Nur77的相互作用.该项研究对基于Bcl-2和Nur77信号转导通路和癌症细胞靶向凋亡的研究具有重要的参考意义.

组氨酸激酶HK853酸碱调控机制的NMR研究

双组分信号转导系统是细菌应对外界刺激和调控自身生理活动的重要系统。组氨酸激酶是双组分信号转导系统的重要组成部分,大多数组氨酸激酶具有多功能性,不仅能自身磷酸化并能把磷酸基团传递给应激调节蛋白(Response regulator,RR)使之磷酸化,还能催化RR的去磷酸化。研究发现组氨酸激酶HK853的功能受pH值调控,该文利用选择性同位素标记方法,通过NMR技术研究了参与HK853与RR468相互作用的关键氨基酸位点。发现DHp结构域His260侧链的pKa值与HK853的磷酸酶活性有很好的对应关系,HK853与底物形成复合物后其pKa值降低,使His260侧链更易于去质子化,有助于HK853磷酸酶活性的提高。阐明了HK853行使磷酸酶功能时的酸碱调控机制。