特异性磷酸二酯酶抑制剂sildenafil增加缓激肽对血-肿瘤屏障的通透性

目的 研究新的cGMP特异性磷酸二酯酶sildenfil抑制剂是否能增加颈动脉灌注缓激肽对脑肿瘤的血-肿瘤屏障的通透性。方法 用放射自显影方法检测单独应用sildenfil,缓激肽以及sildenfil与缓激肽伍用时血-肿瘤屏障通透性的变化。结果sildenfil与缓激肽伍用与单独应用缓激肽相比较,能显著增加反映血-肿瘤屏障通透性的指标单向转运系数Ki值(P<O.O5)。经缓激肽灌流的肿瘤组织中cGMP含量显著增加(P<O.05)。结论特异性磷酸二酯酶抑制剂sildenafil与缓激肽伍用能显著增加血一肿瘤屏障的通透性,从而能够增加药物选择性地转运到脑肿瘤组织。cGMP可能是缓激肽选择性增加血-肿瘤屏障的重要因素之一。

缓激肽B2受体在大鼠C6脑胶质瘤细胞上的表达

目的 研究缓激肽选择性开放脑肿瘤的血肿瘤屏障的机制。方法 通过双重免疫组化染色 ,确定缓激肽B2受体是存在于血管内皮细胞上还是存在于肿瘤细胞上。结果 在正常脑组织和肿瘤的血管内皮细胞上未见缓激肽B2受体的表达 ,而在肿瘤细胞上发现了高水平表达的缓激肽B2受体。结论 肿瘤细胞上B2受体的高水平表达可能是小剂量缓激肽灌注能够选择性开放恶性脑肿瘤的血 -肿瘤屏障而未影响正常血脑屏障通透性的重要原因之一。

缓激肽选择性增加局部脑缺血大鼠血脑屏障的通透性

目的 研究颈动脉灌注小剂量缓激肽对缺血后血脑屏障通透性的影响及机制。方法 免疫组化分析正常脑组织的缓激肽B2受体所在。大鼠大脑中动脉结扎 1h或 2h再灌流 1h。用放射自显影方法检测缓激肽对血脑屏障通透性的变化。WesternBlot方法检测bNOS ,iNOS和B2受体。NOS检测盒检测NOS的活性。结果 正常脑组织毛细血管内皮未见B2受体表达 ,在神经细胞上发现B2受体的表达。缺血 2h再灌流1h缓激肽灌注缺血区血脑屏障通透性显著增加。WesternBlot结果提示 ,在缓激肽灌注组和对照组间 ,缺血皮质区bNOS和B2受体没有明显变化 ,各组中均未检测出iNOS。缓激肽灌注组的NOS活性显著高于对照组。结论 正常脑组织毛细血管内皮未表达B2受体 ,神经细胞上可见B2受体的表达。

腺病毒介导的白介素12对恶性脑肿瘤的基因治疗

目的 构建表达鼠白介素 1 2 ( IL-1 2 )基因的重组腺病毒 ( Ad/ IL-1 2 ) ,并测试对小鼠 GL-2 6脑胶质瘤的实验治疗。方法 将 IL-1 2的 P3 5 和 P40 的两个亚单位基因分别插入腺病毒的 E1和 E3区 ,构建 Ad/ IL-1 2。结果 肿瘤内注射 Ad/ IL-1 2显著地延长了动物的生存时间 ,有 3 0 %的动物生存期超过了 6个月。离体脾脏细胞CTL分析没有检测出 T淋巴细胞溶解活性 ,而从肿瘤内收集的 T淋巴细胞却有强烈的杀伤活性。结论 局部表达IL-1 2是一个很有潜力的治疗脑胶质瘤的手段 ,这种治疗效果源于肿瘤特异性克隆 T淋巴细胞的肿瘤内浸润。

高表达缓激肽B2受体的大鼠胶质瘤模型的研究

目的建立高表达缓激肽受体(B2R)的大鼠胶质瘤模型,为研究缓激肽选择性开放血脑屏障的机制及解决目前临床应用中存在的问题提供必要的模型。方法①大鼠B2R的真核细胞的表达和其载体(prB2R)侵染C6胶质瘤细胞株;②Real-timeRT-PCR测定B2R的转录;③WesternBlot法测定B2R的表达水平。结果①大鼠胶质瘤细胞株C6高表达B2R;②Real-timeRT-PCR测定C6-B2R1和C6-B2R2克隆的B2R分别比C6对照高7.6和6.9倍;③C6-B2R1和C6-B2R2克隆的蛋白表达水平高于C6对照克隆的3.8和3.78倍。移植C6-B2R1肿瘤1周后的B2R表达水平高于C6对照肿瘤的3.6倍。结论高表达B2R的大鼠胶质瘤模型已被成功建立。

大鼠局灶性脑缺血再灌注早期血脑屏障通透性变化的研究

目的探讨大鼠局灶性脑缺血再灌注早期血脑屏障通透性及紧密连接蛋白claudin-5、occludin和蛋白激酶Cδ(PKCδ)表达的变化。方法采用线栓法制作大鼠局灶性脑缺血再灌注模型,伊文思蓝法检测血脑屏障的通透性变化,免疫组化和Western blot方法检测脑缺血组织claudin-5和occludin的表达,Western blot方法检测脑缺血组织PKCδ蛋白的表达。结果伊文思蓝法结果表明,与假手术组比较,血脑屏障通透性在缺血1 h、缺血2 h、再灌注0.5 h、1 h、2 h时显著升高(P<0.01)。免疫组化和Western blot结果显示,与假手术组比较,脑缺血组织血管内皮细胞claudin-5和occludin的表达亦在缺血1 h、缺血2 h、再灌注0.5 h、1 h、2 h时显著下降(P<0.01);而PKCδ蛋白在缺血1 h、缺血2 h、再灌注0.5 h、1 h、2 h时表达显著上调(P<0.01)。结论大鼠局灶性脑缺血再灌注早期血脑屏障通透性的增加可能与claudin-5、occludin表达下降和PKCδ蛋白激活有关。

紫草素对脑胶质瘤干细胞干性维持的相关研究

目的研究紫草素对脑胶质瘤干细胞(GSCs)干性维持的影响及相关分子机制。方法应用免疫荧光方法对分离提取的细胞球进行干细胞表面标志性分子CD133和nestin的检测;紫草素(2μmol·L-1)处理GSCs 12、24和48 h后,光镜下观察紫草素对GSCs悬浮细胞球形态的影响;采用亚球形成实验评估紫草素对GSCs自我更新能力的影响;应用Western blot方法检测紫草素作用下GSCs干细胞标志分子CD133的表达变化,同时检测紫草素作用下,GSCs中PI3K、p-PI3K、Akt和p-Akt的表达变化;联合应用胰岛素样生长因子-1(IGF-1)后检测紫草素作用下,GSCs干性维持的改变。结果分离提取的细胞球表面CD133和nestin呈阳性表达;紫草素能够明显抑制GSCs悬浮细胞球的形态和二代细胞球的形成,同时能够降低CD133的表达;与对照组相比,紫草素作用下,GSCs中PI3K和Akt的表达无变化,pPI3K和p-Akt的表达呈现药物时间依赖性明显下降;此外,IGF-1能够明显改善紫草素对GSCs干性维持的抑制作用。结论紫草素能够明显抑制GSCs的干性维持,其机制可能与PI3K/Akt信号通路有关。

大鼠原代脑微血管内皮细胞体外分离与培养的实验研究

目的探讨获取大鼠脑微血管内皮细胞（BMEC）的简单、有效方法,为构建体外血肿瘤屏障（BTB）模型提供材料。方法采集出生3~5 d的Wistar胎鼠大脑皮质,应用酶消化法及葡聚糖离心法获得脑微血管段后,接种于培养皿中进行原代培养,采用倒置显微镜对所培养的细胞进行形态学观察;以Ⅷ因子相关抗原免疫组化染色法鉴定细胞;将BMEC与C6脑胶质瘤细胞共培养,构建体外BTB模型,并采用免疫组化法和免疫荧光法检测BMEC间紧密连接相关蛋白occludin的表达。结果体外培养2 h时脑微血管段贴壁,12-48 h见圆形生发中心形成,2-3 d单层内皮细胞自生发中心长出,4-5 d见较大单层内皮细胞团,5-7 d可见融合成片的内皮细胞单层,外观呈＂铺路石＂样;第Ⅷ因子免疫组化结果显示＂铺路石＂样细胞胞质呈棕黄色染色;紧密连接相关蛋白occludin的免疫组化和荧光结果证明共培养的BMEC间表达BTB的特性。结论本方法能成功地进行大鼠原代BMEC培养,构建大鼠体外BTB模型,进而应用于BTB的生理、生化及药理学研究。

大鼠脑微血管内皮细胞的原代培养及其生物学行为初步探讨

本文旨在探讨建立稳定的大鼠原代脑微血管内皮细胞的培养方法,并对其血脑屏障特性进行初步研究。通过匀浆、葡聚糖高速梯度离心提取大鼠脑皮层微血管段,用胶原酶消化后,在37℃,5%CO2孵箱中进行原代及传代细胞培养,以跨内皮阻抗值分析其血脑屏障特性随传代次数的改变。结果证明:原代培养后7～10d沿微血管段生成单层"铺路石"样细胞,经VIII因子证实95%以上的培养细胞是血管内皮细胞,通过传代可以进一步纯化,得到稳定的脑微血管内皮细胞系,原代培养的脑微血管内皮细胞表现出很强的屏障特性,与内皮细胞株之间有显著差异,随着传代次数的增加脑微血管内皮细胞的跨内皮阻抗减弱。以上结果表明,采用匀浆、梯度离心、胶原酶消化是获取大鼠脑微血管内皮细胞稳定的方法,原代培养的脑微血管内皮细胞是研究血脑屏障的最佳技术手段。

紧密连接相关蛋白Claudin-5、ZO-1在大鼠蛛网膜下腔出血后早期脑损伤中的表达及意义

目的通过观察大鼠蛛网膜下腔出血(SAH)后早期脑皮层紧密连接相关蛋白Claudin-5、ZO-1表达的变化及JNK抑制剂SP600125对其表达的影响,探讨SAH后早期脑损伤的机制。方法成年雄性SD大鼠75只,随机分成假手术组(sham组)、SAH组、SAH+DMSO组、SAH+SP600125(10 mg/kg)组和SAH+SP600125(30 mg/kg)组5组。采用血管内穿刺法建立大鼠SAH模型,在SAH后24 h时,应用电镜观察各组脑皮层微血管血脑屏障形态学变化;应用Western blot检测各组中脑皮层Claudin-5、ZO-1表达的变化。结果 SAH后早期脑皮层微血管发生明显损伤改变;与sham组相比,SAH组出血后24 h Claudin-5、ZO-1的表达水平明显降低(P<0.05),c-Jun氨基端激酶(JNK)抑制剂SP600125明显改善了脑皮层微血管形态学损伤程度,并抑制了Claudin-5、ZO-1表达水平的降低。结论大鼠SAH后早期血脑屏障结构破坏是早期脑损伤关键性机制之一;SP600125可能通过抑制细胞凋亡、保护血脑屏障发挥SAH早期脑损伤的神经保护作用。

神经胶质瘤nNOS和cGMP表达水平与其病理级别相关关系的研究

目的：分析神经胶质瘤中神经元型一氧化氮合酶（nNOS）和cGMP表达水平与病理级别的相关关系。方法：免疫组化法和Westem blot法测定标本中nNOS的表达水平；放射免疫法测定相同组织中cGMP的表达水平。结果：HE染色显示，36例神经胶质瘤中Ⅰ级为11例，Ⅱ级为14例，Ⅲ级为11例。免疫组化结果显示，在病理级别为I、Ⅱ和Ⅲ级的神经胶质瘤中，nNOS的平均光密度值（OD）分别为0．1717±0．013 6、0．2744±0．0150和0．3684±0．015 0，Ⅰ、Ⅱ级比较及Ⅱ、Ⅲ级比较，差异均有统计学意义，P值均为0．000；神经胶质瘤中nNOS表达水平与其病理级别Ⅰ～Ⅲ级显著正相关，r=0．984，P=0．000，呈Ⅰ〈Ⅱ〈Ⅲ级。Westem blot结果显示，在病理级别为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ级的神经胶质瘤中，nNOS与β-actin的整合光密度值（IDV）之比分别为1．0900±0．0347、1．2242±0．0292和1．5398±0．0433，Ⅰ、Ⅱ级比较及Ⅱ、Ⅲ级比较，差异均有统计学意义，P值均为0．000；神经胶质瘤中nNOS表达水平与其病理级别Ⅰ～Ⅲ级显著正相关，r=0．953，P=0．000，呈Ⅰ〈Ⅱ〈Ⅲ级。放射免疫结果显示，在病理级别为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级的神经胶质瘤中，cGMP的浓度分别为（0．0034±4-0．0009）、（0．0063±0．0013）和（0．0132±0．0049）pmol／mg，Ⅰ、Ⅱ级比较及Ⅱ、Ⅲ级比较，组间差异均有统计学意义，P值分别为0．017和0．000；神经胶质瘤中以MP表达水平与其病理级别Ⅰ～Ⅲ级显著正相关，r=0．796，P=0．000，呈Ⅰ〈Ⅱ〈Ⅲ级。结论：神经胶质瘤中nNOS和cGMP表达水平与其病理级别Ⅰ～Ⅲ级显著正相关，提示利用缓激肽（bradykinin，BK）及其类似物开放血肿瘤屏障的疗效差异可能与两者表达水平有关。

七叶皂苷钠抗大鼠脑出血后脑水肿作用及其机制

目的探讨七叶皂苷钠(10mg.kg-1.d-1)抗大鼠脑出血后脑水肿的作用及其机制。方法采用♂Wistar大鼠右侧基底核注入50μl自体全血的方法建立模型,并在模型建立后6,24,48或72h处死大鼠。应用干湿重法、酶学方法、免疫组化法和Western blot法,测定各组大鼠脑组织含水量,Na+,K+含量,神经胶质原纤维蛋白(GFAP)阳性细胞和紧密连接相关蛋白occludin表达的变化。结果与假手术组比,模型组出血同侧脑组织含水量,Na+含量和GFAP阳性细胞均明显增加(P<0.05),K+含量和occludin的表达明显减少(P<0.05);与模型组比,治疗组出血同侧脑组织含水量,Na+含量和GFAP阳性细胞明显减少(P<0.05),K+含量和occludin的表达则明显增加(P<0.05)。结论七叶皂苷钠可减轻和(或)延缓脑出血后脑水肿的发生,进而改善脑出血的预后。

低频超声体外诱导C6胶质瘤细胞凋亡的研究

目的应用低频超声辐照体外培养的C6胶质瘤细胞,探讨低频超声对肿瘤细胞的影响。方法应用不同强度(10%～100%)的低频超声(1MHz,20s)作用于体外培养的C6细胞,采用MTT法检测光密度(OD)值,计算超声辐照后C6细胞的生长率,应用TUNEL法观察C6细胞的凋亡形态及计算细胞凋亡率。结果低频超声辐照体外培养的C6胶质瘤细胞后,在超声强度<50%范围内,随超声强度增加C6细胞的生长率显著下降,细胞形态出现核浓缩和核碎裂等凋亡改变,细胞凋亡率随超声辐照强度增加而增加;当超声强度>50%时,C6细胞的生长率和凋亡率不随超声强度增加而改变。C6胶质瘤细胞凋亡率与生长率显著负相关。结论低频超声辐照能够在体外诱导C6胶质瘤细胞凋亡。

基质金属蛋白酶对胶质瘤干细胞侵袭作用的影响

目的:分别在体内及体外条件下,观察恶性胶质瘤肿瘤干细胞(Cancer Stem cells,CSCs)的侵袭能力,检测恶性胶质瘤不同细胞亚群的基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和-9(MMP-9)的表达,探讨其与CSCs侵袭能力的相关性。方法:应用神经干细胞(neural stem cells,NSCs)培养基体外分离培养原代恶性胶质瘤细胞,应用自我更新分析、免疫细胞化学染色、体内成瘤分析等技术鉴定CSCs细胞亚群。分别在体内、体外条件下,应用细胞侵袭分析技术观察不同肿瘤细胞亚群的侵袭能力,应用实时RT-PCR、Western blot、免疫组织化学染色方法,检测不同肿瘤细胞亚群中MMP-2、MMP-9的表达情况。结果:原代培养的恶性胶质瘤细胞被分离鉴定为CSCs和非肿瘤干细胞(non-CSCs)。胶质瘤CSCs的促侵袭能力明显强于non-CSCs;MMP-2的表达水平在两个细胞亚群间存在显著差异(P<0.0001),且均明显高于MMP-9表达;在胶质瘤CSCs接种的动物脑组织中,MMP-2与MMP-9的表达均呈时间依赖性增高,MMP-9则仅在肿瘤组织中表达,其表达增长率高于MMP-2,且主要定位于肿瘤的边缘。结论:在不同的条件下,胶质瘤CSCs可能是通过MMP-2或MMP-9促进了肿瘤细胞的侵袭及肿瘤的侵袭性生长。特异性抑制胶质瘤CDCs明胶酶分泌,尤其是MMP-9,将为抗肿瘤治疗提供有效的手段。未来针对于CSCs与其它MMPs家族成员及其抑制剂的研究将有利于进一步阐述胶质瘤的侵袭机制,同时也将为抗恶性胶质瘤的治疗提供新的策略。

儿童颅咽管瘤的显微手术治疗及并发症的处理

分析我院采用5种入路手术治疗的65例儿童颅咽管瘤手术患者的资料。随访患者52例,其中长期生存患者47例,正常学习生活者43例。术后出现并发症患者62例(95.4%),以神经内分泌紊乱,下丘脑垂体损害,电解质紊乱等并发症为主。认为完善术前准备、精心选择和设计手术入路,监测及治疗术后水电解质紊乱及激素水平低下是成功治疗的关键。

干细胞因子对骨髓间充质干细胞定向迁移的影响

目的初步探讨干细胞因子对大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stemcells,BMSCs)定向迁移的影响。方法密度梯度离心和贴壁培养法分离培养BMSCs,并予以传代。利用RT-PCR方法检测BMSCs对干细胞因子受体c-kit的表达,使用Transwell小室建立体外趋化迁移模型,评估干细胞因子对BMSCs定向迁移的影响以及p38丝裂原活化蛋白激酶通路(p38MAPK)抑制剂SB203580对干细胞因子诱导BMSCs迁移能力变化的影响。结果通过密度梯度离心和贴壁培养法获得了纯化的MSCs。RT-PCR证实BMSCs表达c-kit;干细胞因子可趋化体外模型中BMSCs通过聚碳酸酯膜向下室内迁移,在0～50ng/mL浓度范围内迁移细胞数量随干细胞因子的浓度增加而增加。加入SB203580后干细胞因子诱导的BMSCs迁移受到抑制。结论干细胞因子可以趋化BMSCs发生定向迁移,这一迁移过程的细胞内信号转导与p38MAPK通路有关。

多层面螺旋CT血管造影在颅内动脉瘤术后评估中的初步应用

目的 初步评估多层面螺旋 CT血管造影 ( m ulti- slice helical CT angiography,MSCTA)在颅内动脉瘤术后复查中的临床应用价值。方法 对 12例临床确诊颅内动脉瘤接受手术治疗病例应用 Aquilion多层面螺旋 CT于术后行 MSCTA检查 ,图像后处理方法包括多层面重建、遮盖容积重建以及外视镜式血管表面重建。结果 对于使用钛制动脉瘤夹病例 ,MSCTA可以清楚显示动脉瘤体消失 ,载瘤动脉与动脉瘤夹之间关系。但对于使用普通合金动脉瘤夹以及 GDC弹簧圈栓塞病例 MSCTA术后重建伪影大 ,难以对动脉瘤体是否消失和载瘤动脉情况作出评价。结论 可以将 MSCTA作为使用钛制动脉瘤夹病例的术后随访工具。

中枢神经系统血管母细胞瘤的诊断与治疗:100例报告

目的探讨中枢神经系统血管母细胞瘤的诊断及治疗。方法回顾性分析2000年至2010年于我院采取显微外科手术治疗的100例血管母细胞瘤患者临床资料,χ2检验用于对比囊性与实质性血管母细胞瘤的手术全切除率。结果肿瘤全切除95例,次全切除5例。囊性肿物全切除率达100%,实质性肿物全切除率达到85.7%。术后神经系统症状明显改善85例,死亡5例。次全切除患者术后辅助γ-刀治疗。除死亡病例外余95名患者中90人得到随访,随访时间为3到72个月(平均46个月),84例患者恢复正常工作生活。行γ-刀治疗的患者复查未见肿瘤增大。复发2例,行二次手术。囊性血管母细胞瘤手术全切除率明显优于实质性肿瘤(χ2=6.99,P<0.01)。结论显微外科治疗中枢神经系统血管母细胞瘤安全有效,术后并发症少。显微镜下手术囊性与实质性总体全切除率达95.0%。对于残留肿物,可辅助γ-刀治疗。

术中脑池内冲洗尼莫地平治疗蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛37例

脑血管痉挛（CVS）是动脉瘤性蛛网膜下腔出血（aSAH）患者严重并发症之一,常导致神经功能进一步恶化。aSAH患者约有70%以上可出现不同程度CVS。尼莫地平对于预防和治疗aSAH患者CVS的作用已得到公认。

脑室-腹腔分流术治疗婴幼儿脑积水的疗效分析

目的总结可调压式分流管治疗婴幼儿脑积水的临床经验,探讨其临床应用价值。方法回顾性分析29例植入可调压式分流管治疗不同类型婴幼儿脑积水的临床资料。患儿均行脑室-腹腔分流术,术中根据侧脑室的测压结果设定分流阀的初始压力,术后根据患儿症状体征的改善情况及影像学结果调整分流阀的压力。结果术后随访3~48个月,患儿临床症状均明显缓解或消失,CT检查显示脑室均较术前缩小。术后感染2例,分流管梗阻3例。结论可调压式分流管具有个体化设定分流阀压力的优点,可有效避免术后分流过度和分流不足的出现,是治疗婴幼儿脑积水的首选方法。