糖化酶单抗的研制及其抗原识别位点的分析

为建立掺糖造假蜂蜜中残留糖化酶的检测方法,用从黑曲霉中提取的糖化酶作为免疫原,免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术获得了12株稳定分泌针对糖化酶抗体的杂交瘤细胞株。单克隆抗体亚型鉴定结果显示,10株为IgG1,2株为IgG2b,轻链均为κ轻链。Western blotting分析结果表明,12株抗体均可特异性结合糖化酶。其中6株单抗(McAb-2H4F9、6H9D8、8F2F11、8F2E9、1A8G6、1C4D5)细胞株采用体内诱生法制备的腹水效价均1∶1×104以上。采用抗体叠加试验对这6株抗糖化酶单抗的抗原识别位点进行检测,反应增殖结果表明,6株单抗分别针对4类不同抗原位点,McAb-6H9D8和McAb-8F2F11针对第Ⅰ种抗原决定簇;McAb-1A8G6和McAb-1C4D5针对第Ⅱ种抗原决定簇;McAb-8F2E9针对第Ⅲ种抗原决定簇;McAb-2H4F9针对第Ⅳ种抗原决定簇。制备的抗体针对不同的抗原表位,为双抗夹心ELISA方法的建立提供前提。

罗丹明B单克隆抗体的制备及初步鉴定

采用N-羟基琥珀酰亚胺活性脂（NHS）法将罗丹明B（Rhodamine B,RB）与牛血清白蛋白（BSA）和卵清蛋白（OVA）分别偶联形成免疫原和检测原,经紫外分光光度计扫描鉴定初步判断偶联成功。以人工合成免疫原免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术获得了3株稳定分泌针对RB抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为2D1、4C3和7F11,将7F11注入BALB/c小鼠腹腔产生腹水,用所得到的腹水建立了间接竞争ELISA（ic ELISA）标准曲线。对ic ELISA的工作条件进行了优化,方阵试验确定了包被抗原的工作浓度为1∶2 000,腹水抗体的工作浓度为1∶64 000。利用RB作药物抑制标准曲线,其线性方程为y=0.2848x-0.2847（R2=0.9924）,线性范围为1-1 000 ng/m L,最低检测浓度为1 ng/m L。交叉试验表明,该单抗与RB的抑制率为100%,与罗丹明6G、罗丹明123、苯酚红、副品红、中性红、曙红Y、橙黄Ⅱ、甲基橙、结晶紫均无交叉反应。

鸽新城疫灭活疫苗效力评价中实验鸽的筛选

为解决鸽新城疫灭活疫苗免疫效力评价中的标准鸽缺失问题,筛选满足要求的试验鸽。2019年3月对鸽场饲养管理和鸽群发病史情况进行调研,筛选合格鸽场;采血进行鸽新城疫抗体检测,排除高母源抗体鸽群;进一步检测鸽圆环、鸽腺病毒和鸽痘,排除感染上述易感病原鸽群;最后对选定的鸽隔离饲养一定时间,排除潜在的病原感染;采用筛选鸽进行鸽新城疫灭活苗免疫攻毒试验,验证是否满足试验的需求。通过调研,确定3家鸽场,从1月龄左右鸽群中随机选择50羽健康鸽进行检测,ND母源抗体为0~1∶32不等,均无鸽腺病毒感染,但有个别鸽存在圆环抗体或携带鸽痘病毒。从其中2家鸽场购回HI抗体≤1∶4,且无其他病原感染风险的鸽各25羽进行鸽新城疫灭活疫苗免疫攻毒试验,血清学检测结果显示,免疫组鸽免后28 d ND HI抗体在1∶16~1∶64之间,均值在1∶32以上;攻毒保护结果为,免疫组17/20~19/20保护,对照组均5/5发病,3~4羽死亡。通过鸽场调研初筛、新城疫HI抗体检测、鸽常见病原检测、隔离观察等步骤筛选的实验鸽可满足鸽新城疫灭活疫苗效力评价试验的要求,且结果稳定可靠。通过该研究筛选的实验鸽,满足试验需求、提高研究结果的可靠性和重复性,并在保证鸽用疫苗质量方面具有重要意义。

鸡马立克氏病meq基因缺失疫苗(SC9-1株)的临床应用效果比较研究

鸡马立克氏病基因缺失活疫苗(SC9-1株)的临床试验分别在3个鸡场进行,试验鸡分别为1日龄雪山黄鸡20 600只、1日龄京红1号蛋鸡17 000只、1日龄北京油鸡9 732只。临床安全性试验观察期内,免疫鸡群的精神状态、采食、饮水情况、生长性能与对照组无异。临床免疫效力试验期间,将免疫SC9-1鸡群与免疫CVI988/Rispens(市售)鸡群进行对比,SC9-1鸡群的死淘率分别为2.7%与0.4%,均低于CVI988/Rispens免疫鸡群的3.7%与1.2%(P>0.05)。另外分别将免疫SC9-1的鸡群与免疫CVI988/Rispens的鸡群在6日龄时攻击马立克超强毒Md5(1 000 pfu/只),结果显示SC9-1株疫苗攻毒保护率分别为35/35与34/35,显著高于CVI988/Rispens株疫苗的25/35与27/35(P<0.05)。以上表明SC9-1株疫苗安全性良好,免疫效力较好,可能是一株理想的马立克氏病疫苗。

猪肺炎支原体套式PCR检测方法的建立及应用

为建立一种用于检测猪肺炎支原体(Mhp)的套式PCR方法,本研究从GenBank中下载Mhp P36基因序列,选取其保守区域基因片段,设计套式PCR的内外套2对特异性引物,经过反应条件优化,建立了Mhp套式PCR检测方法。用该方法对Mhp 168株、鸡毒支原体、猪鼻支原体、猪链球菌、胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒进行特异性检测。结果显示,除了Mhp 168株能扩增出外套793 bp和内套448 bp的目的条带,其余病原均未扩增出相应的片段,特异性较强;该方法对Mhp的最低检测限为10拷贝/μL,敏感性是常规PCR方法的100倍。对50份含Mhp的培养基经本研究建立的套式PCR、常规PCR、Mhp分离培养方法的阳性检出率分别为88%、82%、88%,套式PCR方法与常规PCR的总体符合率为94%,与Mhp分离培养方法的符合率为100%。本实验建立的套式PCR方法,为Mhp的流行病学调查提供了检测手段。

3株H9N2亚型重组禽流感病毒生物学特性及免疫原性研究

为评估经反向遗传技术构建的3株H9N2亚型重组禽流感(AIV)病毒A3-PR8株、AH515-PR8株和TM343-PR8株的生物学特性和免疫原性,研究将3株重组毒株在鸡胚上连续传代,3株重组毒株均能在鸡胚中稳定增殖,红细胞凝集价达到9.0 log2。与对应的亲本分离株相比,重组毒株的病毒含量(EID_(50))提升0.5~0.8个滴度。以3株重组毒株为抗原制备油乳剂灭活疫苗,0.2 mL/只接种21日龄SPF鸡,免疫后第7、14、21、28天采血,测定血清中H9亚型AIV的血凝抑制试验(HI)抗体效价,结果显示,免疫后28 d三种疫苗免疫鸡几何平均HI效价都可达8.0 log_(2),AH515-PR8株免疫组抗体效价最高达8.8 log_(2)。免疫后28 d分别以10^(6.0) EID_(50)的剂量进行H9N2 AIV WJ57株的攻毒保护试验,在攻毒后,AH515-PR8和TM343-PR8组免疫鸡均不发病、不死亡,排毒量有明显下降,其中AH515-PR8株免疫组排毒量最低,5 d病毒分离率为0。研究表明,经反向遗传技术构建的AH515-PR8株相较于TM343-PR8株和A3-PR8株,更具有生长繁殖能力和强免疫原性的特点,为H9N2亚型禽流感疫苗的应用和开发提供了参考。

美国兽医微生物学课程教学模式对我国兽医专业授课方式的启示——美国堪萨斯州立大学兽医学院访学体会

《兽医微生物学》是面向动物医学专业学生开设的一门专业课程,包括兽医微生物实验等辅助课程,具有较高的应用性与实践性。传统上,该课程由专任教师按章节循序渐进地讲授理论知识,学生通过结合教材中的内容进行课下的复习与巩固;兽医微生物实验则由任课教师提前准备器材或试剂等相关材料,课堂上在规定时间内完成实验内容。这种传统授课模式使教师更加专注教材理论及实验指导,忽略了从学生角度发挥的主动性与积极性。笔者从国内教学模式和美国堪萨斯州立大学(Kansas State University)兽医学院授课方式的角度进行对比,分析两种方式在《兽医微生物学》课程实施过程中的差异,为提高该课程的教学质量和激发学生高水平的科研素养提供一定启示。