14种中药及其组方对临床常见致病菌的抑菌作用

观察了诃子、黄连、黄芩、五味子、紫花地丁、金银花、栀子、柴胡、大黄、郁金、穿心莲、白头翁、陈皮、苦参等14味中药及其组方的水煎剂对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、巴氏杆菌等I临床常见致病菌的体外抑菌作用，以及对鸡体内大肠杆菌一巴氏杆菌联合攻毒保护作用的差异。结果表明：诃子、五味子、黄连、黄芩、金银花、柴胡对大肠杆菌有明显抑制作用；黄连、黄芩、诃子、大黄、五味子、金银花对巴氏杆菌抑制作用较好；黄芩、大黄、诃子、黄连、五味子对金黄色葡萄球菌体外抑菌作用明显。由上述药物为主药组成的中药方剂（方1～方3）的体外抑菌作用弱于单味药，但对体内大剂量细菌攻毒的保护作用强于单味药，且以方1、方2作用更好。

塞内卡病毒CH/ZZ/2016株cDNA感染性克隆的构建

为构建塞内卡病毒(Senecavirus A)CH/ZZ/2016株的感染性克隆,采用RT-PCR技术分3个cDNA片段对SVA/CH/ZZ/2016株全基因组进行扩增,并克隆至pcDNA3.1(+)真核表达质粒中。获得重组质粒pSVA-CH/ZZ经NheⅠ、KpnⅠ酶切及测序鉴定后,转染BHK-21细胞并转至PK-15细胞上进行盲传,直至出现细胞病变(CPE)。对出现CPE的细胞上清液进行RT-PCR扩增、酶切、测序、间接免疫荧光试验鉴定。结果显示,成功构建了含SVA全长cDNA克隆的重组质粒,转染BHK-21细胞经PK-15细胞盲传至F5代出现SVA的典型CPE。细胞上清液经RT-PCR扩增、酶切、测序结果表明拯救病毒含有不同于亲本病毒的分子标记。间接免疫荧光试验进一步表明拯救了SVA病毒。病毒蚀斑形成和生长曲线表明,拯救毒株和亲本毒株的复制能力及增殖特性相似。本研究构建的CH/ZZ/2016株感染性克隆为进一步研究SVA的致病机理、基因功能及疫苗的研发奠定基础。

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

为体外表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)糖基化囊膜蛋白GP5,以及制备其多克隆抗体,以PRRSV PC疫苗株RNA为模板,应用RT-PCR扩增GP5基因,并克隆至原核表达载体pET-32a(+),构建重组表达载体pET-32a-GP5。经过酶切和测序鉴定后,将阳性重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,加入IPTG低温诱导表达。使用亲和层析法纯化PRRSV GP5蛋白。然后将纯化的蛋白免疫北京大耳白兔制备多克隆抗体,并进行酶联免疫吸附试验(ELISA)和间接免疫荧光分析(IFA)。结果显示,表达的PRRSV GP5原核蛋白以可溶性和包涵体两种形式存在,相对分子质量大约30 kDa;制备的GP5蛋白多克隆抗体ELISA效价可达1:64000;IFA检测显示,制备的多克隆抗体能够识别PRRSV。重组PRRSV GP5蛋白及其多克隆抗体的成功制备为PRRSV血清学检测方法的建立提供了良好的生物学材料。

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5重组蛋白对外周血单个核细胞功能的影响

为了研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5重组蛋白(rGP5)对猪外周血单个核细胞(PBMC)功能的影响,本研究选取PRRSV-PC疫苗株中的ORF5基因片段,对其进行原核表达并纯化,结果显示rGP5以可溶性和包涵体两种形式表达,分子质量约为30 ku;将该纯化蛋白免疫大耳白兔,按常规方法制备抗血清并进行酶联免疫吸附试验(ELISA),结果显示,纯化后的rGP5可以与PRRSV阳性血清特异性结合;制备的兔抗rGP5多克隆抗体效价高达1.64 000,可用于后续试验。无菌采集PRRSV阴性猪外周血并分离PBMC,加入终浓度为10μg/mL的rGP5体外培养后,采用间接免疫荧光试验(IFA)检测重组蛋白与PBMC的结合,结果显示rGP5与PBMC共培养1 h后,PBMC出现红色荧光,表明r GP5可以结合PBMC。进一步采用不同浓度的rGP5体外刺激猪PBMC,利用ELISA方法检测淋巴细胞中IL-10、IFN-γ、TGF-β1及TNF-α的分泌水平,同时采用CCK-8细胞增殖检测试剂盒测定rGP5对PBMC增殖的影响,以及不同浓度的rGP5刺激PBMC分泌NO的情况,结果显示,不同浓度的rGP5均显著促进PBMC细胞因子IL-10、IFN-γ和TNF-α的分泌(p<0.05);同时rGP5能够促进PBMC增殖(p<0.05),也能增加NO分泌(p<0.05),上述结果表明GP5是PRRSV重要的抗原,发挥着重要的免疫作用。本实验首次研究了rGP5对猪PBMC免疫功能的影响,揭示PRRSV影响宿主免疫反应的具体机制,有助于阐明PRRSV与宿主细胞相互作用的分子基础,为进一步研究其免疫保护性提供了实验依据。

犬腺病毒和犬细小病毒双重TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

为建立犬腺病毒(CAV)和犬细小病毒(CPV)双重荧光定量PCR检测方法,本研究根据GenBank中已登录的CAV Hexon基因序列和CPV VP2基因序列,设计了2对特异性引物和2条Taq Man探针。经过条件优化建立了检测CAV和CPV的双重TaqMan荧光定量PCR检测方法。结果显示,以含有CAV Hexon基因和CPV VP2基因的重组质粒标准品为模板绘制标准曲线,其相关系数(R^2)均大于0.990,CAV和CPV荧光定量PCR均具有良好的线性关系。特异性试验结果显示,该方法仅对CAV-I型、CAV-II型和CPV检测结果为阳性,而对犬瘟热病毒、犬副流感病毒和犬冠状病毒检测结果均为阴性,表明其特异性强。该方法的敏感性检测结果显示其检测下限为10拷贝/μL。重复性试验结果显示该方法的组内和组间变异系数均小于2%,表明该方法重复性好。利用普通PCR方法与本实验建立的方法分别对感染CAV(10份)和CPV(27份)的犬模拟病料样品进行检测,两种方法对CAV和CPV检测的符合率分别可达100%和96.30%。本研究建立的荧光定量PCR检测方法具有快速、敏感、准确等优点,可以用于CAV和CPV的临床检测。