柔嫩艾美耳球虫Cathepsin B基因的克隆表达及活性研究

旨在利用同源克隆法从柔嫩艾美尔球虫(Eimeria tenella)中克隆组织蛋白酶B基因(Etcat B),为进一步研究其基因表达和基因功能奠定基础。选用未孢子化的柔嫩艾美耳球虫Houghton株,通过对已公布的柔嫩艾美尔球虫序列进行分析,利用RT-PCR的方法克隆EtcatB基因的cDNA序列,并将其重组于transE1原核表达载体中,鉴定后,重组质粒转入大肠杆菌Rosetta进行诱导表达。利用纯化所得Etcat B蛋白制备兔抗多抗,同时利用明胶酶谱法初步验证其活性。利用Real-time PCR和Western blot的方法检测Etcat B在球虫发育不同阶段和孢子化不同阶段的表达水平。成功克隆得到一个长度为1 539bp的Etcat B基因,并重组表达了球虫的组织蛋白酶B。SDS-PAGE电泳结果显示,在1mmol·L-1 IPTG 37℃诱导4h下,主要以包涵体的形式表达;4℃过夜诱导可以使之转为可溶性表达。表达产物在低pH、有还原剂存在的环境中,可以降解明胶,初步证明重组表达的酶具有一定的活性,Etcat B在配子体和裂子体时期表达较高,未孢子化和子孢子阶段表达相对较低,孢子化过程中表达逐步增加。Etcat B基因的克隆和表达研究,为进一步探究该基因在鸡球虫入侵及其他生物学功能中所起的作用提供了理论基础。

我国首次牛结节性皮肤病病毒的分离鉴定

牛结节性皮肤病(LSD)是由羊痘病毒属牛结节性皮肤病病毒(LSDV)引起的牛的烈性传染病。2019年8月,我国首次在新疆伊犁地区发现疑似LSD疫情。本研究采集伊犁疫情临床症状典型病牛病变皮肤组织,接种羊睾丸(LT)细胞,对出现典型细胞病变的培养物进行了系列鉴定。透射电镜观察到典型痘病毒形态的砖型粒子;山羊痘高免血清间接免疫荧光检测培养病变细胞显示阳性反应;LSDV基因组特异引物PCR检测结果为阳性;二代测序(De novo)全基因组分析显示与LSDV/Russia/Saratov/2017(MH646674.1)同源性最高(99.42%);系统进化分析显示与LSDV/Russia/Saratov/2017株相似,介于疫苗株和野毒株分支之间;病毒生长曲线测定显示感染LT细胞的生长特性与已报道的山羊痘病毒相似。上述结果表明,本实验分离得到引起我国首次LSD疫情的病毒株,命名为LSDV/China/Xinjiang/2019株(Xinjiang/2019),本研究为牛结节性皮肤病的防治奠定了基础。

埃博拉和马尔堡病毒囊膜糖蛋白嵌合型重组水泡性口炎病毒的构建及鉴定

埃博拉病毒(EBOV)和马尔堡病毒(MARV)属于丝状病毒科,能够导致人和动物发生致命的埃博拉出血热和马尔堡出血热,这两种病是重要的尚未传入我国的烈性人兽共患病。为研制安全有效的储备疫苗,本研究利用水泡性口炎病毒(VSV)反向遗传操作技术,将VSV自身糖蛋白(GP)分别替换为EBOV或MARV的GP,构建了表达扎伊尔型EBOV、苏丹型EBOV及MARV GP的嵌合VSV重组病毒r VSV△G/ZEBOVGP、r VSV△G/SEBOVGP及r VSV△G/MARVGP。Western blot和间接免疫荧光试验表明这3种GP蛋白在重组病毒感染的细胞中均能够正确表达。电镜观察结果显示,3种重组病毒均与亲本病毒具有相同形态特征,表明这3种外源GP蛋白均能够嵌合在重组病毒粒子表面。本研究构建的这3种重组病毒为进一步的动物免疫试验并评价其免疫效果奠定了基础。

非洲猪瘟病毒结构蛋白基因重组痘苗病毒的构建及鉴定

非洲猪瘟(ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的一种猪的传染病,发病率和死亡率几乎达100%,是尚未传入我国的重要的猪烈性病。为研制安全有效的ASF储备疫苗,本研究利用本实验室改造的痘苗病毒(VV),将ASFV的结构蛋白P72和P54或CD2v和P30的基因分别插入到VV基因组中,构建了同时表达P72和P54的重组VV(rVV-P72-P54)以及同时表达CD2v和P30的重组VV(rVV-CD2v-P30)。Western blot和间接免疫荧光试验表明外源基因在重组病毒感染的细胞中均能够正确表达。这两株重组病毒在体外细胞培养中的增殖效率与亲本病毒无显著差异。该研究为进一步的动物免疫实验奠定了基础。

莱斯顿型埃博拉病毒GP蛋白嵌合型水泡性口炎病毒的构建与免疫原性研究

莱斯顿型埃博拉病毒(REBOV)可以感染猪和非人类灵长类动物并引起动物发病和死亡,为制备安全、有效的REBOV重组病毒后备疫苗,本研究利用表达绿色荧光蛋白的水泡性口炎病毒(r VSV-EGFP)印第安纳弱毒疫苗株反向遗传操作系统,拯救出了REBOV GP蛋白嵌合型VSV(r VSV△G*GFP-REBOV-GP),并对其生物学特性进行分析,评估其作为REBOV活疫苗的安全性和有效性。激光共聚焦和western blot试验显示REBOV GP蛋白在嵌合病毒中获得正确表达;病毒生长动力学结果显示,r VSV△G*GFP-REBOV-GP与亲本株具有不同的生长特性;将r VSV△G*GFP-REBOV-GP接种小鼠,未引起小鼠发病,体重增长趋势与对照组一致,表明嵌合病毒具有良好的安全性;中和试验结果表明该嵌合病毒能够诱导小鼠产生针对REBOV GP的高滴度中和抗体。本研究制备的r VSV△G*GFP-REBOV-GP为进一步的动物免疫实验奠定了基础。

鸡白介素17A的克隆表达及活性测定

从经人工感染柔嫩艾美尔球虫孢子化卵囊(1×104个/只鸡)的盲肠上皮间淋巴细胞(IELs)提取总RNA,用RT-PCR方法成功扩增了鸡白介素17A(IL-17A)基因,测序结果显示,开放阅读框为453bp,编码150个氨基酸,与GenBank上鸡IL-17A基因(AM773756)的核苷酸和氨基酸序列完全一致(100%),与报道的哺乳动物IL-17A的氨基酸相似性达37%～46%。构建的pGEX-6p1-chIL-17A原核表达载体经1mmol/L IPTG诱导后表达出43kDa左右的融合蛋白,与预期大小一致,且Western-blot鉴定表达产物为目的蛋白。功能试验表明,表达的重组鸡IL-17A能够刺激鸡胚成纤维细胞产生IL-6。这些结果表明,鸡IL-17A在结构和功能方面与哺乳动物的IL-17A都有一定的相似性,可能在鸡的免疫应答过程中起到重要的作用。

融合域点突变的埃博拉病毒GP蛋白重组新城疫病毒的构建与免疫评价

扎伊尔型埃博拉病毒(EBOV)的感染会引起人类以严重出血和发热为主要症状的传染病,死亡率高达90%,对公共卫生构成严重威胁。EBOV囊膜蛋白(GP)是病毒主要的免疫原性蛋白。本团队前期的研究表明,以新城疫病毒(NDV)为载体构建表达EBOV GP蛋白的重组病毒rLa-EBOVGP改变了NDV的侵入方式。为了研制出安全性更高的埃博拉候选疫苗株,本研究将EBOV GP蛋白的融合域I532突变为R后插入NDV LaSota疫苗株(rLa)基因组中,通过反向遗传学操作拯救表达EBOV GP(I532R)蛋白的重组NDV,并将经PCR鉴定正确的重组病毒在鸡胚中连续传代检测了其的体外遗传稳定性。RT-PCR鉴定结果显示,EBOV突变的GP(I532R)蛋白基因正确插入了NDV基因组中,表明获得了重组病毒rLa-EBOVGP(I532R);在鸡胚中连续传20代后,经RT-PCR扩增EBOV GP(I532R)基因后经测序鉴定,结果显示rLa-EBOVGP(I532R)能够保持良好的遗传稳定性。利用蔗糖梯度超速离心法纯化rLa、rLa-EBOVGP和rLa-EBOVGP(I532R)病毒,分别进行western blot检测。结果显示,EBOV GP和GP(I532R)蛋白均能够正确表达;将rLa、rLa-EBOVGP和rLa-EBOVGP(I532R)分别感染BHK-21细胞后,利用激光共聚焦试验分析EBOV GP(I532R)的表达和定位,结果显示GP(I532R)能够表达且位于BHK-21细胞的细胞膜上;对纯化病毒利用免疫电镜观察病毒颗粒,结果可见rLa-EBOVGP(I532R)与亲本病毒rLa结构特征相似,且GP(I532R)蛋白能够嵌合在重组病毒粒子表面;生长动力学试验结果表明,rLa-EBOVGP(I532R)与亲本株rLa在鸡胚中的生长特性基本一致,且能够稳定增殖;分别将重组病毒rLa-EBOVGP和rLa-EBOVGP(I532R)经肌肉注射和滴鼻两种途径免疫小鼠,经稀释血清固定病毒的方法分别检测各组小鼠针对NDV和EBOV GP蛋白的中和抗体。结果显示rLa-EBOVGP(I532R)能够诱导小鼠产生较高的针对NDV和EBOV GP蛋白的中和抗体。以上结果表明rLa-EBOVGP(I532R)具有作为防控EBOV感染的储备性候选疫苗株的潜力。本研究为进一步研究GP(I532R)的生物学功能奠定了基础。

表达重症急性呼吸综合征病毒刺突蛋白重组新城疫病毒的构建及其免疫原性研究

重症急性呼吸综合征(SARS)是一种急性、发热并伴有呼吸系统甚至多脏器感染的人兽共患病。虽然自2004年以来未见SARS感染病例相关报道,但是2019年12月我国湖北省武汉市暴发的新型冠状病毒肺炎(COVID-19)疫情表明SARS冠状病毒(SARS-CoV)或者类SARS冠状病毒(SARSL-CoV)在人群中再次大面积流行的可能性极高。本研究首先构建了表达SARS-CoV刺突蛋白(S蛋白)的全长cDNA克隆pBRN-FL-SARS-CoV-S,并利用新城疫病毒(NDV)LaSota疫苗株反向遗传操作系统,拯救出表达SARS-CoV S蛋白的重组病毒rLa-SARS-CoV-S并鉴定。将rLa-SARS-CoV-S以MOI 0.01的剂量感染BHK-21细胞36 h后分别通过western blot和激光共聚焦试验对SARS-CoV S蛋白进行检测,结果显示S蛋白在感染的细胞中能正确表达并准确定位于细胞膜上。将rLa-SARS-CoV-S以1×104 EID50的剂量接种10日龄的SPF鸡胚后在不同时间点收集尿囊液并测定EID50,病毒的生长动力学曲线显示rLa-SARSCoV-S能够在鸡胚中高滴度生长,与亲本病毒一致。将rLa-SARS-CoV-S和亲本病毒10倍倍比稀释后接种10日龄的SPF鸡胚并记录每个鸡胚的死亡时间,按病毒最高稀释度引起鸡胚的死亡时间计算鸡胚平均致死时间(MDT),结果显示rLa-SARS-CoV-S的MDT为112.8 h,NDV LaSota的MDT为96 h,说明该重组病毒仍然保持NDV LaSota疫苗株的低致病力特性。将rLa-SARS-CoV-S和NDV LaSota分别以5×106 EID50的剂量通过肌肉注射接种6周龄的BALB/c小鼠并在第21 d加强免疫,同时设置PBS对照组。小鼠安全性试验结果显示接种rLa-SARS-CoV-S的小鼠全部存活并且无任何临床症状,体质量增长情况与NDV LaSota组及对照组保持一致;免疫后21 d和42 d对小鼠采血制备血清,通过ELISA检测小鼠体内针对SARS-CoV S蛋白的IgG抗体水平,结果显示在初免和加强免疫后该重组蛋白均可以诱导小鼠产生较高水平的特异性IgG抗体,并且抗体水平可以维持较长一段时间。本研究结果表明rLa-SARS-CoV-S具有作为SARS-CoV候选疫苗的潜在价值,同时为研发SARS-CoV-2疫苗提供思路。

柔嫩艾美耳球虫感染鸡的盲肠上皮间淋巴细胞表达白介素17的动态变化

以1×104个柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)孢子化卵囊感染10日龄AA肉鸡,于感染后第24、48及72小时分离鸡盲肠上皮间淋巴细胞(IELs)。提取鸡盲肠IELs总RNA,用实时荧光定量PCR方法检测IL-17的表达动态;然后用FITC标记的抗鸡CD4单抗和PE标记的抗小鼠IL-17单抗作为抗体对盲肠IELs进行荧光抗体染色,再进行流式细胞术分析,检测了表达IL-17的CD4+盲肠IELs在柔嫩艾美耳球虫感染后的动态变化。实时荧光定量PCR结果表明,鸡在感染柔嫩艾美耳球虫后能够显著上调IL-17mR-NA的表达水平,流式细胞分析结果表明,在球虫感染后表达IL-17的CD4+细胞数量显著上升。这些结果表明,IL-17参与了宿主抵抗球虫感染的反应。