mm-LDL对內皮细胞转录因子NF-kB活性的影响

目的 研究轻微修饰低密度脂蛋白(mm-LDL)激活内皮细胞转录因子NF-kB的信号传导途径以及NF-kB对血小板源性生长因子B链(PDGFb)表达的调控作用。方法 以FeSO4修饰法制备mm-LDL，以正常LDL(n-LDL)作对照，作用于培养内皮细胞后提取核蛋白，用凝胶阻滞实验检测转录因子NF-kB核转位及结合活性的变化。观察自由基清除剂probucol及PDTC对mm-LDL激活内皮细胞转录因子NF-kB的影响。通过检测报告基因探讨核因子诱导激酶（NIK）和核因子-kB抑制亚基激酶(IKK)在激活内皮细胞转录因子NF-kB的信号传导途径中的作用以及mm-LDL激活的NF-kB对PDGFb基因启动子的作用。结果 mm-LDL能激活培养内皮细胞转录因子NF-kB, 自由基清除剂probucol和PDTC对mm-LDL激活内皮细胞转录因子NF-kB无明显抑制作用。变异型NIK及IKK能显著降低报告基因荧光素酶的活性，mm-LDL激活的NF-kB还能增加带有PDGFb基因上游调控序列（-189/＋43）的报告基因荧光素酶的活性。Slot blot结果显示变异型NIK能显著减少受mm-LDL刺激的内皮细胞 PDGFb mRNA含量。结论 mm-LDL可通过NIK-IKK途径激活内皮细胞转录因子NF-kB并促进PDGFb基因表达。

反义MCP-1转染兔平滑肌细胞及对其生长的影响

构建逆转录病毒载体反义单核细胞趋化蛋白1（LUCX-Anti-MCP－1）表达质粒，利用阳离子脂质体（Lipofectamine）将反义MCP－1导入体外培养的平滑肌细胞，通过PCR、Northern杂交检测外源基因的转染及其mRNA表达情况。应用3H胸腺嘧啶核苷（3H－TdR）掺入法了解反义MCP－1基因对细胞生长的影响．结果显示：Lipofectamine可以成功的将反义MCP－1基因导入体外培养的主动脉平滑肌细胞中，并实现外源基因的转录表达。且反义MCP－1基因对体外培养的平滑肌细胞生长没有影响。

反义大鼠凝血酶受体基因的构建及其对主动脉血管平滑肌细胞增生的影响

凝血酶激活凝血酶受体引起的一系列细胞事件和内源性PDGF-A，bFGF的产生可能是血管病变发生发展过程中平滑肌细胞增生的重要因素。为进一步阐明血管损伤后平滑肌细胞增生的机理及探索有效治疗途径，针对凝血酶受体基因中一段包括转录起始点，翻译起始点，凝血酶结合和切割位点的序列作为靶序列，构建了凝血酶受体反义RNA重组表达载体pLXSN／ATR，并将其导入凝血酶刺激的动脉平滑肌细胞。结果表明重组基因转染能抑制凝血酶对大鼠平滑肌细胞DNA合成的刺激作用。提示序列特异的凝血酶受体反义重组基因的表达可以抑制凝血酶受体介导的血管平滑肌细胞增生。

载脂蛋白/卵磷脂脂质体对培养的平滑肌细胞内胆固醇的清除作用

目的：探讨载脂蛋白ＡＩ／卵磷脂脂质体和载脂蛋白ＡＩＶ／卵磷脂脂质体在胆固醇逆向转运过程中的作用和意义。方法：应用脱氧胆酸透析方法，制备载脂蛋白ＡＩ／卵磷脂脂质体和载脂蛋白ＡＩＶ／卵磷脂脂质体，观察它们对培养的胎儿主动脉平滑肌细胞内３Ｈ－胆固醇的清除能力。结果：载脂蛋白ＡＩ／卵磷脂脂质体或载脂蛋白ＡＩＶ／卵磷脂脂质体的胆固醇清除率与高密度脂蛋白相似，且明显大于单独的载脂蛋白ＡＩ或载脂蛋白ＡＩＶ（Ｐ＜０．００１）；当两种脂质体以不同比例混合时，其清除率随混合物中载脂蛋白ＡＩ／卵磷脂脂质体含量的增加而增大。结论：寻找适当比例混合的载脂蛋白ＡＩ／卵磷脂脂质体和载脂蛋白ＡＩＶ／卵磷脂脂质体有望明显增强单一脂质体对平滑肌细胞内胆固醇的清除作用。

兔血清高密度脂蛋白载脂蛋白A-I的制备

免血清先经硫酸右旋醣酐沉淀、浓缩HDL,然后再超速离心分离HDL,经脱脂后再进行大柱床体积Sepha-dex G-150凝胶柱层析,较大批量地分离apoA-I,一次可获碍纯品数百毫克,经鉴定为apoA-I.可满足实验室或临床对apoA-I大量使用的需要。

高脂血清对易感和不易感动脉粥样硬化动物的动脉平滑肌细胞生长的影响

体外培养家兔和树鼩为主动咏平滑肌细胞,分别观察各自的高脂血清对平滑肌细胞生长的影构,以~3H-胸腺嘧啶核苷(~3H—TdR)掺入细胞DNA,用液体闪烁计数器计数。结果表明:兔高脂血清对兔平滑肌细胞生长有显著的增殖作用,而树鼩高脂血清对树鼩平滑肌细胞的生长未见显著的促进增生作用。

高密度脂蛋白及载脂蛋白A_1防止实验性动脉粥样硬化斑块形成

根据临床流行病学调查和实验研究,已明确高密度脂蛋白（HDL）和缺血性心脏病（动脉粥样硬化）的发病率呈负相关。动脉粥样硬化的发生和血清HDL-胆固醇的量降低有密切关系,HDL是一保护因子,可防止动脉粥样斑块形成。HDL是一种脂质和蛋白的复合体,组成它的主要载脂蛋白有apoA1, A2,A4,apoB,apoC和apoE等,其中以apoA1所占的比例最大,约为65％。体外细胞实验表明,HDL抑制低密度脂蛋白（动脉粥样硬化的主要致病因子）穿过动脉内膜。

雷帕霉素聚乳酸-聚乙醇酸共聚物纳米粒子对人脐动脉平滑肌细胞细胞周期时相、p27蛋白表达及细胞增殖的影响

目的评估本实验室自制包载雷帕霉素(RPM)的聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)纳米粒子(NPs)对离体培养的人脐动脉平滑肌细胞(HUASMC)细胞周期时相、p27蛋白表达和细胞增殖的影响。方法按不同浓度RPM-PLGA NPs设定药物作用组,并设立RPM组、PLGA组和M231培养基及平滑肌细胞生长添加剂(M231-SMGs)组作为对照。采用细胞免疫组织化学染色比较不同处理组HUASMC p27蛋白表达阳性率和表达水平的差异,流式细胞技术评价各处理组对HUASMC细胞周期时相的影响,噻唑蓝(MTT)比色法观察不同浓度RPM和RPM-PLGA NPs对HUASMC存活率的影响。结果10μg/L及以上浓度的RPM和50μg/L及以上浓度的RPM-PLGA NPs可明显抑制HUA-smc生长,并呈浓度依赖性。细胞计数绘制生长-时间曲线显示,100μg/L RPM和500μg/L RPM-PLGA NPs作用于HUASMC 24 h后细胞计数值明显低于M231-SMGs对照组;单纯PLGA NPs对细胞生长无明显影响;与PLGA组和M231-SMGs培养基对照组相比,RPM组和RPM-PLGA NPs组G_0/G_1期细胞比例明显增多,S期及G_2/M期细胞比例明显减少(P均<0.01),但两组间细胞周期时相比例差异无统计学意义(P>0.05)。细胞免疫组织化学染色结果显示,100μg/LRPM和500μg/L RPM-PLGA NPs组的HUASMC p27蛋白表达阳性率和表达水平与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05),但均较PLGA组和M231-SMGs培养基组明显增加(P<0.01)。结论RPM-PLGA NPs抑制体外培养的HUASMC生长效果与RPM相似,并可显著抑制体外培养HUASMC p27蛋白表达,阻抑其细胞周期进程于G_1/S期而抑制其细胞增殖。

表达反义单核细胞趋化蛋白-1的重组逆转录病毒对家兔动脉平滑肌单核细胞趋化蛋白-1基因表达的影响

为研究反义单核细胞趋化蛋白－１ 转基因表达对单核细胞进入动脉壁的作用，首先构建了表达反义单核细胞趋化蛋白－ １ 基因的逆转录病毒重组体，并观察它在培养的细胞中的表达。将家兔单核细胞趋化蛋白－ １ ｃＤＮＡ 反向插入到ｐＬＮＣＸ，构成ＬＮＣＸ－ａｎｔｉ－ ＭＣＰ－１ 重组病毒质粒。再将重组质粒转染φ－２ 细胞，继以φ－ ２ 细胞产生的病毒上清感染ＰＡ３１７细胞，取得Ｇ４１８ＰＡ３１７ 抗细胞克隆。上述细胞经扩增培养，收集病毒上清并感染ＮＩＨ３Ｔ３ 细胞后进行检测。结果发现，病毒的滴度为５．６×１０７ ＣＦＵＬ，感染的ＮＩＨ３Ｔ３ 细胞中有重组病毒的整合。重组病毒感染培养的家兔动脉平滑肌细胞后，用聚合酶链反应检测发现，感染的平滑肌细胞基因组ＤＮＡ中有重组病毒整合；ＲＮＡｓｌｏｔ 杂交结果显示，感染的平滑肌细胞中有反义单核细胞趋化蛋白－１ 的表达，与未感染的平滑肌细胞相比，感染的平滑肌细胞中单核细胞趋化蛋白－ １ ｍＲＮＡ 的表达明显受到抑制。结果提示，反义单核细胞趋化蛋白－ １ 逆转录病毒表达载体在培养的动脉平滑肌中能表达反义基因并抑制靶基因的表达。

包载雷帕霉素的乳酸-乙醇酸共聚物纳米粒子对人脐动脉平滑肌细胞bcl-2、p27^(kip1)表达及细胞凋亡的影响

目的观察雷帕霉素(RPM)及其乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)形成的载药纳米粒子(RPM-PLGA-NPs)在不同浓度和作用时间下对离体培养人脐动脉平滑肌细胞(HUASMCs)细胞凋亡及调控基因bcl-2、p27kip1表达的影响。方法离体培养HUASMCs细胞并分别予不同浓度的RPM、RPM-PLGA-NPs作用12和24 h,设立生理盐水及空白PLGANPs对照组,免疫组织化学方法检测p27kip1与bcl-2表达阳性率和表达水平的差异,采用流式细胞仪、DNA片段琼脂糖凝胶电泳及末端原位标记法检测各组HUASMCs凋亡及细胞凋亡率,噻唑蓝比色法观察不同浓度RPM和RPM-PLGA-NPs对HUASMCs存活率的影响。结果 RPM及RPM-PLGA-NPs组抑制HUASMCs增殖并呈剂量依赖关系,HUASMCs DNA电泳呈梯度条带阳性。流式细胞仪检测RPM 100 ng/ml和RPM-PLGA-NPs 500 ng/ml组的细胞凋亡百分率分别为(45.45±2.36)%和(35.04±5.64)%,显著高于对照组的(2.60±0.95)%(P<0.01)。末端原位标记法检测高剂量干预组的24 h凋亡指数显著高于12 h组(P<0.05,P<0.01)。RPM 100 ng/ml组和RPM-PLGA-NPs 500 ng/ml组的p27kip1蛋白阳性表达指数(PEI)分别为(0.178±0.077)%和(0.192±0.052)%,显著高于对照组的(0.101±0.035)%(P<0.05)。Spearman秩相关检验显示RPM及RPM-PLGA-NPs组凋亡指数值与p27kip1的PEI无相关性。RPM-PLGA-NPs 50 ng/ml及RPM 10 ng/ml组bcl-2的PEI分别为(6.44±1.31)%和(5.49±1.06)%,显著高于对照组的(1.84±0.47)%和(2.06±0.53)%(P<0.05)。结论 RPM及RPM-PLGA-NPs上调离体培养的HUASMCs的p27kip1表达、促进细胞凋亡,并无下调抗细胞凋亡基因bcl-2表达的作用。相当载药量的RPM-PLGA-NPs较RPM促进血管平滑肌细胞凋亡的作用更明显,但与p27kip1表达水平无线性相关。

纳米粒子载反义单核细胞趋化蛋白-1基因局部定位转染抑制兔颈动脉内膜损伤后内膜增生的研究

目的 观察纳米粒子包载反义单核细胞趋化蛋白 1 (MCP 1 )基因局部腔内转染对兔颈动脉球囊损伤后内膜增生的影响。方法 采用球囊导管损伤动脉内膜的方法建立兔颈动脉球囊损伤模型。用纳米粒子包载反义MCP 1基因 ,采用保留灌注的方法进行局部腔内定位转染。结果 聚合酶联反应检测发现重组基因整合 ,RNANorthern杂交观察到转基因治疗组有反义MCP 1基因表达 ,内源性MCP 1基因的表达受抑制 ,转基因治疗组内膜 /中膜面积比降低 42 %。结论 纳米粒子可以作为转基因载体 ,反义MCP

小鼠病毒性面神经炎模型中面神经元凋亡的研究

目的探讨1型单纯疱疹病毒（herpes simplex virus type 1，HSV-1）性面神经炎动物模型中面神经运动神经元（facial motor neurons，FMN）的凋亡情况以及凋亡相关基因bcl-2和bax的表达。方法Balb／c小鼠84只，分别进行HSV-1接种和面神经切断处理。在操作后第1、3、7、10、15、20及30天分批处死动物，对面神经核进行HE染色、尼氏染色；采用原位末端转移酶标记（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling, TUNEL）技术检测FMN的凋亡；免疫组化染色检测凋亡相关基因bcl-2和bax在FMN中的表达。结果面神经切断后，同侧FMN出现凋亡，在第10、15天达高峰，Bcl-2表达降低，Bax表达升高，Bcl-2／Bax比值下降；接种病毒后，同侧FMN没有明显的细胞凋亡，Bcl-2表达增高，在第15天达高峰，Bcl-2／Bax比值上升。结论小鼠面神经接种HSV-1后FMN没有明显凋亡，可能与神经损伤程度轻以及HSV-1抑制宿主细胞凋亡有关，Bcl-2、Bax可能参与调控FMN的凋亡。

血浆高密度脂蛋白对内皮祖细胞生长特性的影响

目的研究血浆高密度脂蛋白(HDL)对脐血内皮祖细胞(EPC)生物学特性的影响。方法应用密度梯度离心法从人脐带血中分离单个核细胞,接种于M200培养液。经血管内皮生长因子(VEGF)诱导后,进行细胞特异性标志物CD133、CD34、血管内皮细胞生长因子受体2和第八因子相关抗原检测,鉴定其分化为内皮祖细胞。在细胞分化的特定阶段,通过MTT、共聚焦显微镜检查和流式细胞术等方法,检测HDL对EPC增殖、抗原表达及细胞周期的影响。结果在细胞分化阶段,HDL明显促进内皮祖细胞增殖,促使细胞由G1期向S期的转化。细胞增殖指数增加15.3%。cyclinD1表达增加89.9%。结论脐带血中含有内皮祖细胞,在一定条件下可分化为内皮细胞。HDL对内皮祖细胞在体外的分化、增殖有重要的调节作用。这为动脉粥样硬化的发病机制研究和防治提供了一个新思路。

反义凝血酶受体基因表达抑制大鼠动脉内膜损伤后内膜增生

目的 了解凝血酶及其受体在血管损伤后动脉内膜增生中的作用 ,以进一步阐明经皮冠状动脉血管腔内成形术 (PTCA)后再狭窄的发生机制 ,为寻找再狭窄的防治途径提供线索。方法 采用球囊导管损伤动脉内膜的方法建立大鼠颈动脉球囊损伤模型。用纳米粒子包装凝血酶受体重组反义基因质粒pLXSN/ATR ,用保留灌注的方法局部定位转染损伤后的大鼠颈动脉。结果 PCR检测发现重组基因整合 ,RNA斑点杂交观察到实验组大鼠颈动脉壁内有重组反义凝血酶受体基因表达 ,正义凝血酶受体基因的表达受到明显抑制 ,反义基因转染组新生内膜、中膜比例降低了 4 0 9%。结论 反义凝血酶受体重组基因转基因表达对大鼠颈动脉球囊损伤后动脉内膜的增生具有抑制作用 ,提示凝血酶及其受体在PTCA后再狭窄过程中有重要作用 。