脂多糖诱导黑龙江林蛙炎症损伤中抗氧化机制的研究

为探究在细菌脂多糖(LPS)诱导下,黑龙江林蛙(Rana amurensis)抗氧化酶活性的变化,以及铁蛋白重链亚基基因(Ferritin-H,Fer-H)参与林蛙机体抗氧化反应的作用机制,本研究以1 m L/只LPS溶液(1 mg/mL)腹腔注射黑龙江林蛙,构建LPS诱导的黑龙江林蛙炎症模型,诱导后各时间点(6 h、24 h、48 h、72 h和120 h)采集组织样品,采用HE染色法观察各组织病变,结果显示,LPS诱导下黑龙江林蛙的肝脏、皮肤以及肌肉组织均出现了损伤,LPS诱导的林蛙炎症模型可以用于后续实验。利用相应的活性测定试剂盒对采集LPS诱导后各时间点林蛙各组织中的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)以及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH)等抗氧化酶活性检测,同时采用荧光定量PCR检测黑龙江林蛙各组织中Fer-H基因转录水平的变化。抗氧化酶活性检测结果显示,和未加LPS的对照组相比,LPS诱导后黑龙江林蛙各组织中SOD、CAT的活性均极显著升高(P<0.01),而GSH活性极显著下降(P<0.01);荧光定量PCR检测结果显示,和对照组相比,在LPS诱导后黑龙江林蛙各组织中的Fer-H基因转录水平均极显著上调(P<0.01)。综上所述,各组织Fer-H基因会通过上调其转录水平参与林蛙的抗氧化应激反应。本研究首次验证了LPS诱导下黑龙江林蛙各组织会出现氧化损伤,并为探究Fer-H基因与两栖类动物抗氧化反应之间的关系奠定了基础。

东北林蛙LEPR基因的克隆及其在感染中的表达分析

为了探究LEPR基因在两栖类的生物学功能,利用嗜水气单胞菌感染东北林蛙建立炎症模型,分析LEPR基因在细菌感染后的表达情况。首先利用RT-PCR技术克隆LEPR基因并进行生物信息学分析,再构建Ah感染的东北林蛙炎症模型;通过苏木精-伊红染色法(HE染色)观察感染后组织病理变化,并利用qRT-PCR技术分析生理状态和感染状态LEPR基因的组织表达规律差异,最后结合免疫组织化学染色对肾脏、皮肤和肌肉等组织中LEPR蛋白表达变化进行检测。结果显示,获得东北林蛙LEPR基因序列长度为3 604 bp,其开放读码框为3 405 bp,共编码1 134个氨基酸;亚细胞定位显示,LEPR蛋白质为具有一次跨膜结构域的膜蛋白;同源性分析证实东北林蛙与两栖类同源性在52.6%以上,表明LEPR的保守程度较低;基于qRT-PCR结果显示,LEPR mRNA在健康东北林蛙心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、皮肤、肌肉和胃等8种组织中均有表达,在皮肤组织中的相对表达量显著高于其他组织;Ah感染后LEPR基因在不同组织中显著上调,但应答时间和水平有所差异;免疫组织化学结果表明,肾脏、皮肤和肌肉LEPR蛋白表达量变化趋势与qRT-PCR结果基本一致。皮肤组织中LEPR基因应答强烈,也说明其可能参与感染过程,为进一步扩展两栖类LEPR基因的免疫学功能研究奠定了基础。

当代消防监督执法队伍建设的融合发展探讨

随着经济的高速发展,传统的消防理念和监管模式已经跟不上时代的发展,需要引进社会消防专业人才,探索消防监督执法队伍建设融合发展的道路,提高消防监督执法人员的水平。基于此,探讨消防监督执法队伍建设现状,分析新时代消防监督执法队伍建设融合发展的措施,从根本上提高消防监督执法水平,更好地服务于人民,推动社会经济的发展。

黑龙江林蛙ferritin H基因克隆及其在细菌侵染下的表达变化分析

铁蛋白广泛存在于生物体内,能够使细胞内的铁元素含量保持相对稳定且能参与机体免疫反应。近年来因细菌侵染,黑龙江林蛙(Rana amurensis)种群数量出现下降趋势,本研究探究铁蛋白基因在细菌感染的林蛙中的表达模式,期望可以为黑龙江林蛙抗细菌感染的机制研究提供参考。本研究首先采用PCR技术扩增黑龙江林蛙铁蛋白H亚基基因的编码区序列并对其进行生物信息学分析;再应用实时荧光定量PCR技术(RT-qPCR)检测黑龙江林蛙被嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)侵染后,铁蛋白H亚基基因在其肝、脾、肾、皮肤以及肌肉组织中的转录水平变化情况;最后采用免疫荧光检测技术,分析嗜水气单胞菌侵染后,黑龙江林蛙铁蛋白H亚基蛋白表达情况。结果表明,该基因编码区长度534 bp,编码177个氨基酸;对该基因氨基酸序列进行分析,其与欧洲林蛙(R.temporaria)相应基因同源性最高,达到98.37%;RT-q PCR结果显示,铁蛋白H亚基基因在黑龙江林蛙组织中广泛存在,在嗜水气单胞菌侵染后,铁蛋白H亚基m RNA在黑龙江林蛙肝、脾、肾、皮肤以及肌肉组织中的表达均显著上调(P<0.01)。免疫荧光检测结果发现,在感染嗜水气单胞菌后,铁蛋白H亚基蛋白在黑龙江林蛙肝和肌肉组织的胞质中均有不同程度表达。综上结果表明,黑龙江林蛙铁蛋白H亚基基因会通过上调表达来响应细菌性感染,由此推测该基因参与了黑龙江林蛙的细菌性免疫应答。

东北林蛙adipor1和adipor2基因克隆及其在感染中的表达分析

脂联素受体1(adiponectin receptor 1,AdipoR1)和脂联素受体2(adiponectin receptor 2,AdipoR2)能够与脂肪组织分泌的脂联素(adiponectin,AdipoQ)相结合,参与机体的多种生理功能。为探究AdipoR1和AdipoR2在嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,Ah)感染下两栖类炎症反应中的作用,通过逆转录-聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)技术克隆东北林蛙(Rana dybowskii)的adipor1和adipor2基因,对adipor1和adipor2进行生物信息学分析;利用实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR)技术分析adipor1和adipor2的组织表达差异,构建Ah感染的东北林蛙炎症模型,通过苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining,HE)观察组织病理变化;再利用qRT-PCR和Western blotting对感染后不同时间点的adipor1和adipor2的表达进行动态检测。结果表明,AdipoR1和AdipoR2均为具有7次跨膜结构域的膜蛋白;系统进化树也显示与两栖类聚为同一分支;基于qRT-PCR和Western blotting结果显示,Ah感染下adipor1和adipor2在转录和翻译水平发生不同程度的上调表达,但应答时间和水平有所差异。综上所述,推测AdipoR1和AdipoR2参与了机体的细菌免疫应答过程,为进一步探究脂联素受体在两栖类的生物学功能提供参考。

东北林蛙瘦素受体叠加转录蛋白基因的克隆及组织表达分析

瘦素受体叠加转录蛋白(leptin receptor overlapping transcript, LepROT)在免疫调节中发挥多种作用。为了获得两栖类LepROT在抗感染中的作用及其机制的信息,首先采用RT-PCR技术克隆东北林蛙的LepROT基因并进行生物信息学分析;再分别构建嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,Ah)与细菌脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)东北林蛙的感染模型,获得组织病理解剖变化特征,并应用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测LepROT基因的变化规律及其对核转录因子NF-κB信号通路的影响。结果表明,LepROT基因长度为396bp,编码131个氨基酸残基,与两栖类同源性在93.74%以上,与哺乳类同源性在86.39%以上,在各个物种中相对保守;感染Ah、LPS后,基因LepROT、NF-κB、IKKα和IKKβ的相对表达量均显著上调(P<0.01),并且不同组织的表达量上调的时间规律不同,推测东北林蛙可能通过LepROT启动NF-κB信号通路发挥抗感染作用,为进一步扩展两栖类LepROT的生物学功能的研究提供了证据。