靶向siRNA阻断Wnt/β-catenin信号通路对子宫内膜异位症患者在位子宫内膜基质细胞VEGF、MMP-9表达的影响

目的通过观察人子宫内膜异位症在位子宫内膜基质细胞β-catenin的表达,及利用siRNA靶向沉默β-catenin基因以阻断Wnt/β-catenin信号通路来观察其下游靶基因血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinases-9,MMP-9)表达的变化,探讨Wnt/β-catenin信号通路在子宫内膜异位症发生机制中的作用。方法采用随机、对照设计,将体外分离、培养的24例子宫内膜异位症患者在位子宫内膜基质细胞分成3组(n=8):空白组、阴性组(以含阴性荧光siRNA 100pmol和转染试剂5μg的混合物转染)以及siRNA干扰组(以含β-catenin siRNA 100pmol和转染试剂5μg的混合物转染),并以10例非子宫内膜异位症患者子宫内膜基质细胞作为正常组。利用Real-time PCR和Western blot方法分别检测子宫内膜异位症在位子宫内膜空白组和非子宫内膜异位症正常组β-catenin的表达。转染24h后,用以上方法分别检测子宫内膜异位症空白组、阴性组和siRNA干扰组β-catenin、VEGF以及MMP-9的表达。结果子宫内膜异位症空白组β-catenin mRNA和蛋白的表达明显高于非子宫内膜异位症正常组(均P<0.05)。子宫内膜异位症siRNA干扰组β-catenin、VEGF以及MMP-9mRNA和蛋白的表达明显低于空白组和阴性组(均P<0.05),而空白组与阴性组之间差异无统计学意义(均P>0.05)。结论子宫内膜异位症在位子宫内膜基质细胞β-catenin的表达明显高于非子宫内膜异位症患者,阻断Wnt/β-catenin信号通路后,其下游靶基因VEGF、MMP-9的表达明显受到抑制。因此,Wnt/β-catenin信号通路可能在子宫内膜异位症的发生机制中起重要作用。

沙拉沙星ELISA快速检测试剂盒的研制及性能鉴定

利用已制备的高亲和力的抗沙拉沙星的单克隆抗体,研制沙拉沙星快速检测试剂盒,并对其性能进行鉴定。结果显示:研制的沙拉沙星试剂盒的标准曲线呈S型,符合4参数logit曲线拟合,相关线性方程为y=-0.384 8x+0.736 3,R2=0.990 1,IC50为4.11 ng/m L,LOD为2.06 ng/m L。与其他药物的交叉反应率(CR%)均低于1%;鸡肝和鸡肉中添加平均回收率分别为85.3%和88.7%,且变异系数均小于15%;试剂盒在4℃条件下保存6个月后检测能力无显著变化。

沙拉沙星完全抗原的合成及多克隆抗血清制备

为了制备沙拉沙星(SARA)多克隆抗血清,采用碳二亚胺(EDC)法将SARA分别与牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OVA)偶联,制备了免疫原SARA-BSA、包被原SARA-OVA。经SDS-PAGE电泳与紫外扫描初步判定偶联成功,然后用免疫原SARA-BSA分别按20、50μg/只的剂量免疫BALB/c小鼠,共免疫3次,每次间隔3周,于最后1次免疫10d后断尾采血,制备多克隆抗血清。采用间接ELISA方法测定多克隆抗血清效价,间接竞争ELISA方法测定其敏感性和特异性。结果显示,制备多克隆抗血清效价均达1∶10 000以上,IC50为623.5ng/mL,且与其他药物交叉反应率低,具有较好的特异性。

沙拉沙星单克隆抗体制备及鉴定

为制备敏感性好、亲和力高、特异性强的抗沙拉沙星（Sarafloxacin,SARA）单克隆抗体,采用碳二亚胺法合成SARA人工抗原,通过免疫BALB/c小鼠,选择血清效价高且敏感性好的小鼠,采用杂交瘤细胞技术进行细胞融合,筛选分泌抗SARA单克隆抗体（Monoclonal antibody,mAb）的杂交瘤细胞株;采用体内诱生腹水法制备SARA mAb,通过间接ELISA和间接竞争ELISA对SARA mAb的免疫学特性进行鉴定。结果表明：小鼠经免疫原免疫后,小鼠多抗血清效价均达到1∶128 000。选择敏感性较好的2号小鼠进行细胞融合,经多次亚克隆后,筛选出1G3、3H3两株杂交瘤细胞株,其中1G3所产SARA mAb效价较高,为1∶512 000,IC_（50）为6.34 ng/mL,亲和常数为8.55×10~8L/mol,与诺氟沙星的交叉反应率为1.06%,与其他药物交叉反应率均低于0.50%。

甲硝唑人工抗原的合成及鼠源多抗的制备

为了获得效价高、特异性好的甲硝唑（metronidazole,MNZ）的小鼠多抗血清,采用琥珀酸酐法将甲硝唑上的羟基改造成羧基,然后通过碳二亚胺法把改造后的甲硝唑分别与牛血清白蛋白（albumin from bovine serum,BSA）和卵清蛋白（ovalbumin,OVA）进行偶联,制备免疫原MNZ-BSA和包被原MNZ-OVA。经紫外扫描和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳初步鉴定偶联成功。将免疫原MNZ-BSA分成20g/只和50g/只2个剂量分别免疫8周龄的BALB/c小鼠。获得了效价高、特异性好的小鼠多抗血清,效价均达到1:104以上,IC50值为61.39ng/mL。

靶向siRNA阻断Wnt/β-catenin信号通路对子宫内膜异位症裸鼠模型异位子宫内膜VEGF和MMP-9表达的影响

目的利用siRNA载体介导的RNA干扰技术靶向沉默β-catenin以阻断Wnt/β-catenin信号通路,观察对子宫内膜异位症裸鼠模型异位子宫内膜血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinases-9,MMP-9)表达的影响,探讨Wnt/β-catenin信号通路促进异位内膜组织粘附、侵袭和转移的作用。方法采用人子宫内膜异体移植方法构建子宫内膜异位症裸鼠模型。将18只子宫内膜异位症裸鼠随机分为3组(n=6):siRNA干扰组、阴性对照组和空白对照组,前两组每日分别腹腔注射100μL siRNA转染复合物(含β-catenin siRNA3μg和转染试剂7.5μg)和阴性对照转染复合物(含阴性对照si RNA3μg和转染试剂7.5μg)1次,共注射5次。末次腹腔注射后24 h断颈处死裸鼠,观察盆、腹腔病灶形成情况,取异位病灶标本。Real time PCR和免疫组织化学检测异位内膜组织β-catenin、VEGF和MMP-9 mRNA和蛋白的表达。结果实验裸鼠共20只,18只成模成活。Real timePCR检测结果显示,与阴性对照组和空白对照组相比,siRNA干扰组β-catenin、VEGF和MMP-9 mRNA表达明显降低(均P<0.05),而后两者之间差异无统计学意义(均P>0.05)。免疫组化结果显示,si RNA干扰组β-catenin、VEGF和MMP-9表达明显减弱,显著低于阴性对照组和空白对照组(均P<0.05),而后两者之间差异无统计学意义(均P>0.05)。结论阻断Wnt/β-catenin信号通路能明显抑制子宫内膜异位症裸鼠模型异位内膜组织VEGF和MMP-9mRNA和蛋白表达。Wnt/β-catenin信号通路可能促进子宫内膜异位症患者在位子宫内膜的异位种植。

高光谱成像在鱼肉品质无损检测中的研究进展

高光谱成像(hyperspectral imaging,HSI)技术作为一种无损、快速、准确的绿色分析技术在水产品品质检测方面得到了广泛应用。集图像与光谱技术优势于一体,HSI技术可同时检测实验样品的物理和几何特征(颜色、大小、形状和质地等),还可以提供内部组成成分的化学和分子信息(水分、脂肪、蛋白及其他氢键物质)。本文主要综述了HSI技术在鱼肉品质快速检测方面的最新研究进展,主要涉及到鱼肉的化学组成、物理属性、微生物污染以及新鲜度等四大方面。同时对HSI技术在鱼肉检测中的应用研究进行了展望,以期开发适用于不同检测要求的在线HSI设备。

氟罗沙星残留检测间接竞争ELISA试剂盒的研制

【目的】利用蛋白质连接技术合成氟罗沙星(FLE)人工抗原,制备FLE高亲和力抗体,通过建立、优化FLE的icELISA检测方法研制出快速、灵敏的FLE残留检测间接竞争ELISA试剂盒。【方法】用DCC法偶联FLE和载体蛋白BSA合成免疫原FLE-BSA,用混合酸酐法偶联FLE和载体蛋白OVA合成包被原FIE-OVA,通过紫外扫描法(UV Scan)和聚丙烯凝胶电泳法(SDS-PAGE)鉴定人工合成抗原。选择经初步鉴定成功合成的FLE-BSA免疫SPF级6—7周龄Balb/c雌性小鼠5只,采用多点免疫法,对小鼠背部皮下4-6点注射免疫,免疫剂量为30μg/只,初免,用FLE-BSA PBS溶液与等体积FCA混合乳化后免疫;20 d后用FLE-BSA PBS溶液与等体积FIA混合乳化后免疫,免疫间隔3周,4次免疫后,利用间接ELISA和间接竞争ELISA测定其多抗血清效价和敏感性,选出效价高、敏感性好的小鼠多克隆血清,建立、优化FLE的icELISA检测方法,确定其包被浓度、包被时间、封闭液选择、封闭时间、抗体工作浓度、二抗稀释度、底物显色时间等条件,制备出FLE快速检测试剂盒,同时测定该试剂盒的灵敏度、精密度、准确度以及特异性等指标,并与高效液相色谱法做相关性比较,同时对市场上购买4个批次的氟罗沙星药品含量进行了实际测定,以确证试剂盒在实际应用中的质量。【结果】通过上述蛋白质连接技术所制备的免疫原经紫外扫描法和聚丙烯凝胶电泳法鉴定,结果显示BSA与FLE偶联后,FLE-BSA波峰整体出现右移且凝胶上BSA的泳动速度大于FLE-BSA,初步证明人工合成抗原偶联成功。通过间接ELISA和间接竞争ELISA方法测定5号小鼠多抗血清得到其效价大于2.5×104,抑制价为162.18 ng·mL-1。通过优化FLE icELISA检测方法,其工作条件:包被浓度:5μg·mL-1;抗体工作浓度:1﹕6400;二抗稀释度:1﹕1000;底物显色时间:10 min。所制备的试剂盒灵敏度为16.22 ng·mL-1,标准曲线回归方程为y=-0.3627x+1.3517(R2=0.9956),与同系药物及其它药物均无明显交叉反应,阳性猪肝样的回收率在67.5%—87.9%,平均78.7%,变异系数在9.34%—10.7%,平均10.0%;阳性猪肉样的回收率在74.0%—88.2%,平均81.42%,变异系数在8.3%—10.4%,平均9.48%;平均变异系数均小于15%;在500、250、150、75、30 ng·mL-15个标准浓度B/B0的批内变异系数在3.39%—6.68%,批间变异系数在4.69%—9.67%。批内和批间平均变异系数分别为5.07%和7.44%,且与HPLC方法具有良好的一致性(R2=0.9988),通过实际测定其结果基本符合2010年版《中国药典》中所规定的含量要求(90%—110%),进一步说明二者具有良好的相关性以及FLE-Kit的准确性。【结论】首次利用两种方法分别合成FLE免疫原和包被原,利用所制备的抗FLE血清建立并优化FLE残留icELISA检测方法,制备出FLE快速检测试剂盒。该试剂盒具有灵敏、准确、简便、快速的特点,为氟罗沙星免疫学快速检测方法的建立奠定了坚实的基础。

不同动脉阻断术在凶险性前置胎盘伴胎盘植入剖宫产中的应用比较

目的:比较腹主动脉球囊阻断术、双侧髂内动脉球囊阻断术和子宫动脉栓塞术3种不同动脉阻断术在凶险性前置胎盘伴胎盘植入产妇剖宫产中的效果。方法:回顾性分析2014年10月至2017年12月在武汉中心医院剖宫产分娩的103例凶险性前置胎盘伴胎盘植入产妇的临床资料,分为子宫动脉栓塞术组(UA组,n=30),腹主动脉球囊阻断术组(AA组,n=34)和双侧髂内动脉球囊阻断术组(IA组,n=39)。比较3组产妇置管情况,剖宫产手术情况及产后情况。结果:3组产妇剖宫产术前置管术时间两两比较,差异均有统计学意义(P<0.05),UA组最短为5.32±2.34分钟,IA组最长为32.18±6.31分钟。UA组胎儿基本未受辐射,AA组胎儿透视时间和接受辐射量显著少于IA组,差异有统计学意义(9.48±3.21秒vs 54.23±23.85秒,t=10.846,P=0.000;2.94±0.78 mGY vs 21.29±13.84 mGY,t=7.714,P=0.000)。3组产妇剖宫产情况比较:UA组手术时间最长(143.45±25.43分钟),AA组手术时间最短(104.23±21.38分钟);UA组的术中出血量、输血比率、输血量及子宫切除率显著高于其他两组(P<0.05);UA组产后血红蛋白浓度显著低于其他两组(P<0.05)。3组产妇剖宫产术后情况比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:腹主动脉和髂内动脉球囊术对凶险性前置胎盘伴胎盘植入产妇剖宫产术中出血控制效果较好,子宫保留率更高。腹主动脉球囊阻断术对母体和胎儿的放射安全性更好。

超高压处理对生鲜调理宫保鸡丁品质的影响

研究超高压处理对生鲜调理宫保鸡丁品质的影响,分别以100,200,300,400,500 MPa的压力,保压15 min,对生鲜调理宫保鸡丁进行超高压处理,与未经高压处理的样品作对照。结果表明,不同的压力处理对样品的pH和TBA影响不显著。随着压力的增加,pH不断增加,TBA变化不大,样品的亮度L*和黄度b*显著增加,而持水性显著降低。