近交系高表达HBV转基因小鼠的建立及表达传代稳定性

将纯化的高表达 1.3copy HBV全基因 ,通过原核显微注射方法 ,建立了近交系 ( Balb/ c)高表达 HBV转基因小鼠模型 ,以血清 HBs Ag为检测指标 ,对该转基因鼠 HBV基因持续表达水平和数代遗传稳定性进行了研究。结果 ,获高表达 HBV( 1.3copy)转基因 Balb/ c小鼠 Founder 2只 ,用回交传代方法 ,本 HBV转基因小鼠已稳定传至第 8代 ,每代转基因鼠阳性率平均保持在 4 4 .6 7% ,性别对 HBV转基因小鼠总体阳性率有影响 ,雄性小鼠的阳性率 ( 4 4.15 % )明显高于雌性小鼠 ( 4 2 .2 6 % ) ( P<0 .0 5 ) ;血清表达 HBs Ag水平较稳定 ,平均为 ( 85 3.2 8± 2 35 .4 3)μg/ L ,雌雄小鼠之间表达水平没有明显差异。

高复制HBV转基因小鼠模型对抗乙型肝炎病毒药物的效应研究

目的:研究高复制HBV转基因小鼠模型对抗乙肝病毒药物的效应评价。方法:选用抗乙肝药物拉咪呋啶、大剂量重组乙肝蛋白疫苗、α-1b型干扰素和RNA干扰在转基因小鼠进行药效及作用机制评价。结果:拉咪呋啶、重组乙肝疫苗、α-1b型干扰素均可使HBV转基因小鼠血清中HBV DNA滴度显著降低。其中后两者还可提高机体脾细胞IL-2和IFN-γ的水平及使分泌IFN-γ脾细胞Elispot斑点数明显增加。将RNA干扰表达载体pU6-siHBV质粒尾静脉注入小鼠体内。注射后5d血清HBsAg下降56.7%,抑制作用持续14d。肝脏免疫组化显示HBcAg阳性细胞明显减少,但血清HBV DNA定量无明显降低。结论:本近交系高复制HBV转基因小鼠模型对抗乙肝药物药效学评估是可靠、可行的。

HBV转基因小鼠脾脏DC的TLR2、TLR9和T细胞Elispot检测分析

目的:进一步研究HBV转基因小鼠免疫状态。方法:应用流式细胞仪和Elispot方法分别对转基因鼠脾脏树突状细胞(DC)的Toll样受体TLR2、TLR9和分泌γ干扰素T细胞功能进行检测。结果:与正常同种鼠比较,HBV转基因小鼠脾树突状细胞表达CD11c及TLR2、TLR9无明显差异,但分泌IFN γ的T细胞对HBsAg特异性刺激产生的斑点数存在显著差异(P<0 0 5 )。结论:提示HBV转基因小鼠的先天和后天免疫状态是正常的。

乙型肝炎病毒转基因小鼠树突状细胞提呈功能的初步研究

目的；探讨HBV转基因小鼠树突状细胞（DC）功能与其免疫耐受状态的相羞生。方法：按改良Steinman方法，对正常非转基因小鼠和HBV转基因小鼠脾脏树突状细胞进行分离，DC经HBeAg预刺激后，再用此DC与ConA共刺激淋巴细胞增殖反应。结果：HBV转基因小鼠的DC细胞数为10^2／孔、10^3／孔、10^4／孔，分别刺激各组小鼠淋巴细胞时，HBV转基因小鼠及非转基因小鼠的淋巴细胞^3H-TdR掺入量均显著低于对照组。结论：提示HBV转基因小鼠的DC提呈功能低下。

HBV转基因小鼠在乙型肝炎研究中的应用

转基因动物技术是本世纪８０年代初发展起来的一项生物技术。随着转基因技术的不断改进，至今已研制出百余种人类疾病转基因动物模型，并被广泛用于生物医学各领域，尤其在传染病、遗传病和肿瘤等方面。这些动物模型为人类疑难疾病研究提供有效手段。乙型病毒性肝炎（以下...

高复制HBV转基因小鼠模型对抗病毒药物拉米夫定评价的研究

[目的]探讨乙型肝炎病毒(HBV)转基因小鼠模型筛选抗HBV药物的可行性。[方法]用公认抗HBV复制药物拉米夫定对我们建立高复制HBV转基因鼠进行实验,选我们建立的1.3copy高复制HBV转基因小鼠20只,随机分成两组,每组10只。采用灌胃针灌胃法给药。对照组灌喂生理盐水,实验组灌喂拉米夫定,剂量为100mg/kg,每天2次,连续灌21d,每7d采血1次。荧光定量PCR检测血清中HBVDNA。[结果]实验组用拉米夫定前小鼠血清HBVDNA5.50±0.42(拷贝数log10数值),3周后HBVDNA已显著降低(4.63±0.57),4周后,小鼠血清HBVNDA为4.08±0.51,停药1周后,再次检测血清HBVDNA,小鼠血清HBVDNA又恢复正常水平(5.70±0.39)。[结论]我们建立的高复制HBV转基因小鼠模型验证了拉米夫定对HBV复制的抑制程度和持续时间,表明该模型可应用于抗HBV药物的筛选、评价研究。

乙型肝炎病毒转基因小鼠树突状细胞提呈功能的初步研究(摘要)

目的:探讨HBV转基因小鼠树突状细胞(DC)功能与其免疫耐受状态的相关性。方法:按改良Steinman方法,对正常非转基因小鼠和HBV转基因小鼠脾脏树突状细胞进行分离。DC经HBeAg预刺激后,再用此DC与ConA共刺激淋巴细胞增殖反应。结果:HBV转基因小鼠的DC细胞数为10~2/孔、10~3/

鸡胆汁中鹅去氧胆酸转化为熊去氧胆酸的研究

以鸡胆汁为原料，通过不和谐梭菌（Ｃ．ａｂｓｏｎｕｍ）的转化作用，使鸡胆汁中部分鹅去氧胆酸（ＣＤＣＡ）转化为熊去氧胆酸（ＵＤＣＡ），并在薄层板上表现为与熊胆相同的胆汁酸组成。该结果为通过细菌转化作用制备ＵＤＣＡ及熊胆替代品研究提供了实验依据。

复制型HBV转基因小鼠遗传稳定性研究

目的：提高复制型HBV转基因小鼠的遗传稳定性。方法：应用回交传代及双杂交育种法，经荧光定量PCR、ELISA和化学发光法研究HBV基因在小鼠体内的复制与表达。结果：HBV转基因小鼠已稳定传至第23代，血清HBsAg达4122．31±2044．74IU／ml，93．93％的转基因小鼠血清HBVDNA达10^4-10^4copies／ml，表达复制水平较早期有显著提高并稳定传代；雌雄小鼠之间表达水平无显著性差异。结论：该转基因小鼠经过培育传代，已成为一个高表达且遗传稳定的复制型HBV小鼠模型。

HBV转基因小鼠免疫耐受机制的实验研究

目的:观察乙型肝炎病毒(HBV)转基因小鼠(Tg鼠)树突状细胞(DC)抗原递呈功能,T淋巴细胞(TC)免疫活化状态和肝细胞(HC)的应答能力,探讨慢性HBV感染免疫耐受形成的机制.方法:用流式细胞术,氚一胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)掺入法,ELISA和免疫组织化学方法,分别测Tg鼠脾DC,TC和HC表面分子,HBsAg刺激淋巴细胞增生反应以及TC产生的细胞因子含量.结果:Tg鼠DC表面MHC-Ⅱ类分子和CDS0表达低下,DC诱导脾淋巴细胞对HBsAg刺激的增生反应减弱,TC分泌的mIFN-γ,mIL-2,mIL-6,mIL-10均显著减少,HC膜MHC-I类分子表达量也降低.结论:Tg鼠DC的HBV抗原递呈功能低下,TC免疫活化受到抑制,HC的应答能力减弱,其中DC功能低下起关键作用.

超声引导下经皮肾活检的安全性、成功率及并发症

目的评价、分析儿童肾活检的安全性、成功率及并发症。方法肾脏病患儿100例在B超引导下经皮穿刺活检,用20g/L利多卡因逐层局部麻醉至肾包膜,不能配合者应用氯硝西泮,镇静后进行。B超定位后,用皮钻或手术刀片于穿刺点皮肤切开0·3～0·5cm切口,在B超监视下将穿刺针逐层进针到达肾脏被膜时,在平静呼吸时嘱患儿屏住呼吸(肾脏位置较高的患儿需深吸气后屏住呼吸),开枪切割,快速拔出穿刺针。术者用手掌压迫穿刺部位10～15min,腹带、沙袋加压包扎。结果99例获得足够肾组织,平均肾小球7～52个[(23.1±12.1)个],满足了光镜、电镜、免疫荧光三镜的需要,并作出完整的病理诊断,1例虽穿刺成功,但全为髓质组织,无肾小球,总成功率99%。其主要并发症:均有疼痛,一过性肉眼血尿3/100例,腰部不适15/100例。无肾周血肿、感染、休克等严重并发症发生。结论超声引导下经皮儿童肾活检安全可靠,成功率高,并发症少,其病理诊断对临床治疗及预后评价具有明确的指导意义。

基因工程动物与现代比较医学研究

比较医学（Comparative Medicine）是对不同种动物（包括人）之健康和疾病现象进行类比研究的科学。其目的是比较研究人和动物各种生命现象，探索生命的普遍规律，从而得以揭示人类各种生命现象的独特规律。早期的比较医学研究主要是把动物和人加以对比研究，著名的有血液循环、牛痘预防天花、狂犬疫苗的发现：近代比较医学主要是应用人工培育的各种实验动物（包括近交系、免疫缺陷以及无菌及悉生动物）建立各种模拟人类疾病的动物模型来进行研究。

慢病毒载体法制备转基因动物研究进展

慢病毒为逆转录病毒的一种,除了具有逆转录病毒的基本特性外,还具有感染静止细胞的特性。最近研究发现,应用慢病毒载体进行转基因动物制备,转基因的效率得到显著提高,使转基因动物研究领域产生突破性进展。本文介绍了慢病毒载体构建的基本原理、慢病毒载体制备转基因动物的常见方法及国内外研究的最新进展。

HBV基因在第20代HBV转基因小鼠中的复制和表达

目的研究HBV基因在已传20代BALB／c-TgN（HBV D型1．3）SWS458小鼠中复制和表达情况。方法采用PCR荧光定量检测法、ELISA检测和免疫组化的方法研究HBV基因在转基因小鼠体内的复制和表达情况。结果F20代BALB／c-TgN（HBVD型1．3）SWB458小鼠血清HBVDNA为（104—106）copy／mL，HBsAg表达量为（124．41±33．46）ng/mL，preS1和HBcAg的OD值分别为0．248±0．076和0．635±0．338。肝组织有HBsAg和HBcAg表达，且HBsAg为胞浆型，HBcAg为核型。结论经过筛选和培育，本转基因小鼠传至20代时HBV基因复制表达稳定，表明我们已经获得一个传代表达稳定的HBV转基因小鼠品系。

微环DNA载体介导的shRNA在HBV转基因小鼠中的抗病毒作用

目的探讨微环DNA载体介导的shRNA对HBV转基因小鼠体内乙肝病毒复制及表达的抑制效应。方法采用分子克隆技术制备靶向HBV基因的shRNA通用质粒p U6-shRNA HBV和微环shRNA质粒p MC-U6-shRNA HBV。将HBV转基因小鼠随机分为微环shRNA组、通用质粒shRNA组和无关质粒对照组,利用水动力转染技术分别导入p MCU6-shRNA HBV、p U6-shRNA HBV及对照载体p U6-control。于转染后第1、7、14、21、28、35天,分别采用Real-time PCR及化学发光微粒子免疫分析法(CMIA)检测转基因小鼠血清HBV DNA及HBs Ag水平,免疫组化染色观察转基因小鼠肝脏HBc Ag的表达。结果质粒注射后第7~21天,p U6-shRNA HBV及p MC-U6-shRNA HBV对转基因小鼠血清HBs Ag的表达及HBV DNA的复制均有明显抑制作用,与p U6-control相比差异有统计学意义(P<0.05);21d后p U6-shRNA HBV组血清HBs Ag及HBV DNA均有所回升,至第35天基本回复至对照水平;至注射后35d,p MC-U6-shRNA HBV依然保持较强的体内抑制作用,与其他两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。免疫组化结果显示,与p U6-shRNA HBV组相比,p MC-U6-shRNA HBV组小鼠肝组织内HBc Ag阳性细胞数明显减少。结论与p U6-shRNA HBV质粒相比,微环shRNA质粒p MC-U6-shRNA HBV对HBV转基因小鼠体内乙肝病毒的抑制作用持续时间更长久。采用微环DNA作为shRNA的体内递送载体与普通的质粒载体相比具有一定优势。

基因重组(酵母)乙肝疫苗对HBV转基因小鼠细胞免疫调节作用

为研究基因重组乙肝疫苗对HBV转基因小鼠的免疫调节作用,取经HBsAg免疫的小鼠脾淋巴细胞,制成5×106细胞悬液,分两份,一份经无佐剂HBsAg体外刺激48h后,取上清检测细胞因子;另一份细胞于培养56h后加入3H-TdR,继续培养16h,测定cpm值。结果表明,转基因鼠经多次免疫8个月后,其脾细胞产生的Th1类细胞因子(IL-2、IFN-γ)及T细胞增殖水平均较单次免疫一周后有显著性提高。而采用不同剂量HBsAg按常规免疫时并不能提高IL-2的水平。结果提示,反复大剂量的HBsAg可以打破HBV转基因小鼠的免疫耐受,上调其细胞免疫功能,这为慢性乙肝的临床治疗提供了实验根据。

复制型HBV(ayw)转基因小鼠血清中病毒颗粒的免疫电镜检测

目的检测复制型HBV(ayw)转基因小鼠血清中HBV病毒颗粒。方法应用密度梯度离心收集病毒颗粒并应用免疫电镜检测。结果发现了直径22 nmHBsAg颗粒和45 nm左右的Dane颗粒。结论本转基因小鼠模型能继续复制,组装并分泌HBV病毒颗粒。

乙型肝炎病毒转基因小鼠中外源基因整合的检测

目的 :了解乙型肝炎病毒DNA序列在乙型肝炎病毒转基因小鼠中的整合情况。方法 :用头尾相接的乙型肝炎病毒全序列基因 ,通过原核显微注射法产生转基因小鼠 ,用C区特异性引物扩增鼠尾DNA检测整合 ,对其中 10只阳性鼠的扩增产物测序。结果 :12 8只仔鼠中 ,14只整合阳性。对 10只阳性鼠测序 ,9只与所转基因序列完全相同 ,1只在173 9、1740位缺失两个碱基。结论 :外源乙型肝炎病毒基因确实整合至小鼠基因组 ,多数为正常整合 ,但也存在缺失整合。

肝康胶囊治疗慢性乙型肝炎疗效观察

肝康胶囊治疗慢性乙型肝炎疗效观察解放军农牧大学药物研究中心（１３００６２）刘光泽宋红峰武世珍解放军农牧大学北方医院何娜伊通县第二人民医院孙忠文【关键词】肝康胶囊乙型肝炎疗效观察本研究中心通过１０余年对熊胆粉研究开发，多方收集比较，现筛选出以熊胆粉为君...

熊精子顶体反应的检测

用Ionophore A23187(I—A)和咖啡因诱发熊精子的顶体反应,采用台盼兰—姬姆萨染色进行检测。根据染色结果可将精子分为四类:a)有正常顶体的活精子,b)无正常顶体的活精子,c)有正常顶体的死精子,d)无正常顶体的死精子。其中B类精子的百分率与仓鼠卵穿透率呈强正相关(r=0.9426,n=6.P<0.01)。