人Hsp90α基因克隆、中试发酵及生物信息学分析

目的:克隆获得人热休克蛋白90α(Hsp90α)基因,构建其原核表达载体,分离纯化重组蛋白,为Hsp90抑制剂的体外筛选奠定基础。方法:TRIzol Reagent法提取K562细胞总RNA,通过RT-PCR获得Hsp90α-cDNA。以该cDNA为模板PCR扩增Hsp90α基因,目的基因和质粒pET28a(+)经NcoⅠ和XhoⅠ双酶切后,连接酶切片段,将重组DNA转化DH5α,酶切及测序鉴定重组体。将构建好的重组质粒转化Rosetta(DE3)菌株,IPTG诱导,经条件优化后进行中试发酵、纯化以及Western blot鉴定。结果:原核表达载体pET28a(+)-Hsp90α成功构建,可在Rosetta(DE3)中正确表达,中试发酵收菌574g且表达产物以可溶性形式存在,纯化产物纯度为97%。结论:利用分子克隆技术建立了Hsp90α基因的原核表达和中试发酵的条件,为更深入地研究其在抗肿瘤治疗中的作用打下基础。

人TRAP1基因的克隆、原核表达及表达条件优化

应用RT-PCR技术,从人白血病多药耐药细胞株K562/ADR中扩增出肿瘤坏死因子受体相关蛋白1(tumor nec-rosis factor receptor-associated protein1,TRAP1)基因的cDNA。选择NdeⅠ和XhoⅠ分别作为上下游引物的酶切位点,将TRAP1基因克隆到带有6×His标签的pET-28a(+)的载体上。重组质粒转化大肠杆菌DH5α中,涂布于含卡那霉素的LB琼脂培养基上,经双酶切鉴定后的阳性克隆送去测序。测序成功的重组质粒pET28a(+)-TRAP1转化大肠杆菌BL21(DE3)中,在IPTG的诱导下,成功表达重组蛋白TRAP1。通过改变诱导温度、诱导时机、IPTG浓度及诱导时间,找出最佳表达条件,使重组蛋白TRAP1表达量最高。结果表明,在39℃条件下,OD600达到0.8时,经终浓度为0.1 mmol/L的IPTG诱导6 h,目的蛋白的表达量最高。该研究为纯化出TRAP1蛋白,进一步研究该蛋白的结构和功能奠定了基础。

人热休克蛋白90AB1基因克隆、原核表达、中试发酵及纯化

通过克隆人热休克蛋白90AB1基因(Hsp90AB1),构建其原核表达载体pET28a(+)-hHsp90AB1,表达纯化获得目的蛋白,为hHsp90靶向药物筛选奠定基础。提取宫颈癌HeLa细胞总RNA,并经RT-PCR获得hHsp90AB1-cDNA。以hH-sp90AB1-cDNA为模板进行PCR体外扩增,胶回收纯化hHsp90AB1。将hHsp90AB1及pET-28a(+)质粒经NdeⅠ和SalⅠ双酶切、胶回收纯化酶切片段后,体外连接酶切片段,使其定向重组,再将重组DNA转化DH5α,经复苏后,在含卡那霉素的LB固体养基上筛选出阳性克隆。挑取LB固体培养基上的单菌落经酶切及测序鉴定,证实为阳性克隆,即pET28a-hHsp90AB1体外重组成功,命名为pET28a(+)-hHsp90AB1。重组质粒转化Rosetta(DE3)菌株,IPTG诱导表达,并对表达条件优化,以及通过SDSA-PAGE和Western blotting分析均表明Hsp90AB1蛋白得到了正确的表达,且表达产物以可溶性形式存在,优化条件下蛋白表达量约占菌体总蛋白13%。接种到18 L发酵罐中试发酵,表达产物经Ni-NTA凝胶亲和层析,蛋白纯度达到98%。

碗米坡水电厂大轴补气噪声治理

碗米坡电厂机组原大轴补气阀在补气时产生的啸叫声最大时达到114.82dB,强噪声严重影响电厂生产环境,补气阀补气不足也对机组稳定性造成不良影响。通过对原大轴补气阀噪声产生进行分析、试验,研制出新型补气阀,并对机组更换补气阀前后的噪声、稳定性与相对效率进行试验,对新型补气装置的性能进行了测试,满足现场安全生产要求。

碗米坡水电站3号机组组合轴承检修完成

2006年3月24日，碗水坡水电厂在3号机B级检修发电机组合轴承项目中，采用厂房桥机加软带起吊组合轴承盖板，缩短了工期，节约了人力物力，确保了机组安全与检修质量。

碗米坡水电厂高分子柔性移动式拦污排调研、选型与应用

碗米坡水电厂在工程设计初期因工程优化时将原有的拦污排从设计中取消,电厂投运以后,库区每年随洪水漂浮而来的工业废料、生活垃圾、水草、树枝等大量流入坝前水库,对电厂进水口拦污栅和机组安全造成严重威胁,本文对拦污排的选型、调研、设计、应用等进行介绍。

窑坡山风电工程大件运输技术探讨

窑坡山是五凌电力在湘第一个山区风电场,经过13个月的工程建设现已全部投产发电,大件运输是风电工程关键的第一步,文章详细介绍大件运输技术要求和关键工序,特别是大件运输的要点、难点、重点。

碗米坡水电厂调速器接力器故障分析及处理

碗米坡电厂#1机自动锁锭接力器在无水调试中发生前端盖油封支撑8个M10×25固定螺栓全部断裂事件,对自动锁锭接力器进行解体检修,找到了螺栓断裂的原因,并处理了设备的重大隐患。