基于QTL和转录组测序鉴定甘蓝型油菜耐旱候选基因

干旱胁迫严重限制了甘蓝型油菜种植面积的扩大和产量的提升。耐旱性是由多基因控制的复杂数量性状,将QTL定位与转录组测序相结合,是鉴定甘蓝型油菜耐旱候选基因的有效手段。本研究对甘蓝型油菜干旱敏感品系三六矮和耐旱品系科里纳-2构建的F2:6和F2:8重组自交系群体幼苗进行正常灌溉和干旱胁迫处理,测定地上部鲜重、地上部干重、叶片相对含水量、丙二醛和可溶性糖含量,利用SSR和SNP多态性分子标记构建遗传连锁图谱,鉴定耐旱相关QTL和候选区间,结合耐旱材料No11和干旱敏感材料No28的转录组测序,筛选耐旱相关候选基因。研究结果表明:干旱胁迫使甘蓝型油菜幼苗地上部鲜重、地上部干重和叶片相对含水量下降,使叶片丙二醛和可溶性糖含量上升;耐旱相关QTL和候选区间分布于A01、A02、A06、A08、A09、A10、C02、C03、C04、C06和C09染色体;对耐旱材料和干旱敏感材料正常灌溉、干旱24 h、36 h和48 h进行转录组分析,主要差异表达基因显著富集到光合作用、脂肪酸代谢、氨基酸代谢、植物激素信号转导、核糖体、昼夜节律及角质、木栓素和蜡质的生物合成等相关途径;将QTL与转录组测序相结合,鉴定到28个耐旱相关候选基因,主要编码FLC、bHLH105、TGA4、TEM1、ERF003、ACO3、CHLI1、LHCB6和PORC等,具有转录因子活性、乙烯产生和信号传导、叶绿素生物合成与结合、叶绿素氧化还原酶以及编码核糖体相关蛋白等功能。这些结果可为揭示甘蓝型油菜耐旱机理及分子标记辅助选育耐旱新品种奠定基础。

干旱胁迫下甘蓝型油菜籽粒含油量和蛋白质含量变化的全基因组关联分析

【目的】干旱是甘蓝型油菜生长发育过程中一种常见的非生物胁迫,严重影响了其产量和品质。联合全基因组关联分析和转录组差异表达分析,筛选干旱胁迫条件下影响甘蓝型油菜籽粒含油量和蛋白质含量变化的候选基因,为解释干旱胁迫下甘蓝型油菜籽粒含油量及蛋白质含量的变化提供理论基础。【方法】利用旱棚盆栽方式模拟干旱胁迫环境,使用183份甘蓝型油菜构成的自然群体,于2019和2020年在模拟干旱胁迫条件下收获2年的籽粒,并进行籽粒含油量以及蛋白质含量的测定,将得到的表型数据与60K芯片的基因型数据(包含34 103个SNP)进行全基因组关联分析,同时,结合相同处理下花后不同干旱时间段(30、40和50 d)的籽粒转录组差异基因数据,筛选共有基因,并利用甘蓝型油菜和拟南芥数据库注释信息、已报道的相关文献和转录组差异基因表达水平鉴定与干旱胁迫下甘蓝型油菜籽粒含油量及蛋白质含量变化相关的候选基因。【结果】通过对2年间籽粒含油量和蛋白质含量的分析,发现材料重复性较好,干旱胁迫造成甘蓝型油菜籽粒的含油量下降,蛋白质含量上升;全基因组关联分析得出的最佳模型主要为一般线性模型下的Q或na?ve模型,共检测出38个显著关联位点(P<1/31597或P<1/31278),主要分布在A03(6个)、A04(8个)和C03(8个)染色体,各位点分别对含油量和蛋白质含量变化的贡献率均超过10%,其中含油量变化位点最大贡献率为23.97%,蛋白质含量变化位点最大贡献率为22.21%。通过整合全基因组关联分析和转录组分析,筛选出256个共有基因,根据基因注释和文献报道鉴定出与干旱胁迫下含油量及蛋白质含量变化相关的25个候选基因,其中包含转录因子(如bZIP transcription factor GBF6、TALE transcription factor ATH1、MYB-like Domain transcription factor MYBD、NAC transcription factor ANAC029和ERF transcription factor ERF111)、相关激酶(如与油脂相关的蛋白激酶CIPK9、水分胁迫响应激酶PIP5K1和代谢相关激酶PFK7)、相关蛋白(如与油脂相关转运蛋白ABCA9、与蛋白相关的存储蛋白CRU3、胁迫响应蛋白HUP26和M10、叶绿体蛋白DG238和CP12)等,涉及生长发育、光合反应、物质运输等多个生物学过程。【结论】鉴定出25个相关候选基因,可能响应干旱胁迫,并影响油菜籽粒蛋白质和含油量的积累。

甘蓝型油菜含油量及皮壳率的QTL分析

【目的】通过构建甘蓝型油菜遗传连锁图谱,对含油量及皮壳率进行QTL分析。【方法】以黄籽亲本GH06和黑籽亲本P174杂交得到的F2:6家系的188个株系为作图群体,利用SRAP、SSR、AFLP及TRAP四种标记构建遗传连锁图谱,在此基础上采用复合区间作图法(CIM)对含油量及皮壳率两个性状进行QTL分析。【结果】图谱包含19个连锁群、300个标记位点,总长为1248.5cM。共得到7个与含油量相关的QTL,单位点遗传贡献率在3.73%～10.46%之间;4个与皮壳率相关的QTL,单位点遗传贡献率在4.89%～6.84%之间。【结论】黄籽油菜具有高含油量的优势;皮壳率对含油量有显著影响;SRAP标记具有较好的检测QTL位点的能力。

甘蓝型油菜种皮色泽相关基因的cDNA-SRAP差异显示

为探寻甘蓝型油菜黄黑籽之间的种皮色泽表达差异的分子基础,探索cDNA-SRAP差异显示的可行性,选用培育7年的重组自交系群体(RILs),根据群体分离分析法(bulkedsegregantanalysis,BSA)构建了种子的RNA混合池,利用cDNA-SRAP法进行了差异显示研究。996对SRAP引物组合扩增出2100条带,2次扩增重复率为65.2%,其中在黄黑籽材料之间重复稳定出现的差异片段有12条,长度在100～300bp之间。选择其中7条差异片段,进行回收、克隆和测序,发现2个片段分别与拟南芥的NAD+ADP核糖转移酶及小肽转移蛋白3具有很高的同源性。结果表明,利用SRAP方法可以对甘蓝型油菜cDNA混合池进行差异显示研究,2条差异片段可能与甘蓝型油菜的种皮色泽基因表达相关。

甘蓝型黄籽油菜种皮色泽QTL作图(英文)

甘蓝型黄籽油菜具有低纤维、高蛋白及高含油量的优点, 因而已成为广大油菜育种工作者研究的重点之一。利用甘蓝型黑籽品系油研 2 号作父本,甘蓝型黄籽品系 GH06为母本,获得 132 个单株的 F2群体;以 AFLP 和 SSR 为主要分析方法,构建了包括 164 个标记的甘蓝型油菜遗传连锁图谱,其中包括 125 个 AFLP 标记、37 个 SSR 标记及一个 RAPD 和一个 SCAR 标记,分布在 19 个连锁群上,覆盖油菜基因组 2 549.8 cM,标记间平均距离 15.55 cM。利用多区间作图法,对种皮色泽 QTL 进行分析,在第 5 及第 19 连锁群上各检测到一个 QTL 位点,分别解释表型变异 46%及 30.9%。

甘蓝型油菜SRAP、SSR、AFLP和TRAP标记遗传图谱构建

以黄籽GH06为母本、黑籽P174为父本杂交得到的第6代重组自交系188个株系为作图群体,通过SRAP、SSR、AFLP和TRAP四种分子标记对该群体进行遗传连锁分析,构建了一张包含20个连锁群、300个标记位点的甘蓝型油菜分子遗传图谱(LOD≥3.0),包括202个SRAP标记、65个SSR标记、23个AFLP标记和10个TRAP标记。图谱总长度1273.7cM,标记间平均距离为4.25cM。连锁群上的标记数在4～56个之间,连锁群长度变动在37.1～109.2cM之间,群内平均图距在1.80～14.20cM之间。LG1包含的标记最多,有56个;标记最少的连锁群(LG9、LG18、LG20)只有4个。LG13的平均图距最大,为14.20cM;LG6的平均图距最小,仅为1.80cM。在整个图谱上,存在图距大于20cM的空隙6个。本研究首次将SRAP及TRAP标记用于甘蓝型油菜遗传图谱的构建,结果表明,SRAP及TRAP标记在甘蓝型油菜遗传图谱的构建上是一种良好的标记系统。

甘蓝型油菜不同抗倒性材料中木质素代谢途径关键基因表达特点

植物体内木质素的含量不仅与植物的抗病性有关,也与植物的抗倒伏性状密切联系。本试验以15个抗倒性等级不同的甘蓝型油菜品种为材料,分别在初花期和青荚期测定茎秆中部木质素含量,同时用qRT-PCR的方法分析了木质素代谢途径中6个关键基因PAL、4CL、C4H、CCR1、CCR2和CAD的表达量差异。结果表明,油菜茎秆木质素从初花期到青荚期平均增加了28%,抗倒性强的材料木质素增加最明显,达到33.5%;不同时期,不同抗倒伏性的油菜茎秆中部木质素含量差异均极显著;各基因表达量在两个时期间差异均显著或极显著,但在不同抗倒性材料间,只有基因PAL、4CL和CCR1表达量间差异显著;基因PAL的表达量与木质素含量相关性最强,4CL基因的表达量与其他关键酶基因表达量相关性最强。综上所述,木质素的合成积累由代谢途径中各个环节关键基因所共同决定,但基因PAL和4CL对木质素的代谢影响更明显。

甘蓝型油菜籽粒含油量、蛋白质、纤维素及半纤维素含量QTL分析

以甘蓝型黄籽油菜GH06和甘蓝型黑籽油菜P174为亲本,通过单粒法连续自交8代构建重组自交系群体,应用SSR标记绘制31个连锁群(LGs)的遗传连锁图谱,图谱总长1437.1cM,相邻标记间的平均距离为3.89cM。对4个不同环境下RIL8群体中每个株系籽粒含油量、蛋白质、纤维素和半纤维素含量进行了近红外检测。性状相关性分析表明,含油量与其他3个性状均表现负相关,蛋白质含量与纤维素和半纤维素分别表现负相关和正相关。结合构建的遗传图谱,采用复合区间作图法分析4个性状QTL,共检测到26个QTL,分布在N2、N3、N8、N9、N11、N13、N16和N17连锁群上,其中8个含油量QTL可解释表型变异的4.96%～21.83%;6个蛋白含量QTL,可解释表型变异的3.12%～14.28%;4个纤维素含量QTL,可解释表型变异的4.60%～17.29%;8个半纤维素含量QTL,可解释表型变异率的6.66%～16.68%。在N8上,发现有含油量QTL与半纤维素含量QTL重叠的区段。在N9上,发现有纤维素含量QTL与半纤维素含量QTL重叠的区段,上述2个区段重叠QTL加性效应方向相反。本研究认为油菜种子含油量、蛋白质、纤维素和半纤维素属于典型的数量性状,受环境影响较大,与这些QTL紧密相关的分子标记可为下一步分子标记辅助育种提供一定技术支撑。

甘蓝型油菜遗传距离与杂种表现和杂种优势相关性分析

选择甘蓝型油菜9个黄籽材料作母本、10个黑籽材料作父本,按NCⅡ法配制杂交组合,考查了亲本及其杂种F1的单株产量、千粒重、蛋白质和含油量。利用AFLP、SSR、SRAP标记技术对亲本材料进行分析。结果表明,基于遗传距离的UPGMA聚类法可将19个亲本材料分为3个组,黄籽材料与黑籽材料分类明显。普通遗传距离与4个性状的杂种表现及杂种优势相关不明显,但用阳性位点计算的特殊遗传距离与4个性状的杂种表现及杂种优势除千粒重外都呈显著相关,但决定系数较小,不能用于杂种优势预测。

两种环境下甘蓝型油菜含油量的差值QTL分析

利用本实验室构建的遗传连锁图谱和复合区间作图法检测重组自交系GH06×P174（SWU-1）和GH06×中油821（SWU-2）群体在2个环境中含油量差值的QTL。以SWU-1群体在2个环境中检测到2个含油量差值QTL,分别位于2个不同的连锁群,单个QTL可解释表型变异的10.31%-12.45%;以SWU-2群体在2个环境中检测到3个含油量差值QTL,分别位于2个不同的连锁群,单个QTL可解释表型变异的6.60%-10.58%。分析结果表明,含油量受环境影响较大,差值的变异幅度达到0-18.66个百分点,变异系数达到58.24%,说明在油菜的油脂合成中,存在对环境敏感和钝感的基因。含油量差值QTL与2个环境中分别检测到的含油量QTL没有明显的连锁关系,初步分析说明对环境敏感或钝感的基因与油脂合成基因不是同一个系统。

甘蓝型油菜胚色素成分的QTL定位

以甘蓝型黄籽油菜GH06和甘蓝型黑籽油菜中油821为亲本杂交,后代通过"一粒传法"连续自交7代构建重组自交系,2007年分别在重庆市北碚区和万州区两个试验基地种植重组自交系群体,利用本实验室已构建的遗传连锁图谱和复合区间作图法(CIM),分析种胚色素的4种主要成分的QTL。结果共检测到31个QTL,分别位于14个不同的连锁群,其中5个花色素含量有QTL,分别位于第1、5、10、16和20连锁群,单个QTL解释表型变异的6.08%～11.67%;10个类黄酮含量有QTL,分别位于第1、3、6、7、12、20和25连锁群,单个QTL解释表型变异的4.48%～11.10%;8个总酚含量有QTL,分别位于第1、2、12、16和20连锁群,单个QTL解释表型变异的5.24%～10.37%;8个黑色素含量检测到QTL,分别位于第5、8、10、12、14和22连锁群,单个QTL解释表型变异的5.44%～11.32%。解释表型变异大于10%的5个QTL,包括2个类黄酮含量QTL,花色素含量、总酚含量和黑色素含量QTL各1个,它们分别解释11.10%、10.20%、11.67%、10.37%和11.32%的表型变异。研究结果表明胚色素表现为多基因控制的数量性状,基因表达受环境影响较大,胚与种皮色素的QTL吻合度不高,推测种皮和胚色素合成可能受不同遗传体系控制,与这些QTL紧密相关的分子标记可以用于胚主要色素的分子标记辅助选择。

甘蓝型油菜蔗糖磷酸合酶(SPS)基因家族成员鉴定及表达分析

蔗糖磷酸合酶(sucrose phosphate synthase,SPS)是调控植物蔗糖合成的限速酶,对光合产物的转运和积累有重要影响。利用拟南芥SPS蛋白保守结构域在甘蓝型油菜基因组数据库鉴定出11个甘蓝型油菜SPS基因家族成员,根据系统进化分析将其分成A、B和C共3个亚家族。基因结构预测表明,SPSC-1有5个外显子,其他SPS基因均有11~15个外显子。顺式作用元件分析表明,油菜SPS基因除含基本的启动子保守元件外,还含有许多与逆境和激素响应相关的顺式作用元件。实时荧光定量PCR结果表明,Bn SPSA1在花中表达量最高,Bn SPSA2在各组织中均有不同程度的表达,Bn SPSB只在叶、蕾和花中表达,BnSPSC在叶中表达量最高,在蕾和花中有少量表达而在其他组织中基本不表达,说明SPS基因在甘蓝型油菜中的表达具有明显的组织特异性;Bn SPSA1和BnSPSC在高生物产量油菜叶片中的表达高于低生物产量油菜,Bn SPSB则在低生物产量油菜中的表达量更高,说明SPS基因与油菜生物产量密切相关。本研究为油菜SPS基因的功能研究和利用奠定了基础。

航天诱变高油酸甘蓝型油菜突变体分子标记的筛选

【目的】利用与候选基因FAD2紧密连锁的SSR标记对航天诱变的高油酸F2群体进行SSR标记分析,筛选与该高油酸性状紧密连锁的SSR标记及分析其突变位点。【方法】F2群体母本10L421为黄籽低油酸高亚麻酸自交系,父本10L422为航天诱变的高油酸低亚麻酸的突变株自交系后代。对4条染色体(A05、A01、C05及C01)上的候选基因FAD2上下游100 kb区域设计的148对SSR引物在两亲本、高低油酸混合池及F2群体中进行分析。亲本及群体油酸含量采用气相色谱分析,根据分子标记结果对F2群体油酸含量进行单标记分析。【结果】有36对引物在亲本间表现多态性,多态频率为24%。其中10对SSR引物在2个亲本和高油酸、低油酸极端群体间均具有相同的多态性。显著性检验和单标记分析表明,A05和A01上与FAD2共分离的SSR标记在0.01显著水平上与油酸性状相关,单标记分析分别解释表型变异31.1%和29.4%。【结论】A05和A01染色体上的FAD2是控制该突变体材料高油酸性状变异的主效位点,且该高油酸突变体是由于A05和A01上FAD2的双隐性突变所致。

甘蓝型油菜株高、第一分枝高和分枝数的QTL检测及候选基因筛选

株高、分枝数及第1分枝高是油菜重要的农艺性状。本研究利用甘蓝型油菜GH06和P174杂交,F2通过单粒法连续自交至F11构建重组自交系群体,利用油菜60K芯片对该群体进行基因分型,构建高密度遗传连锁图谱。结果表明,该图谱包含2795个SNP多态性标记位点,总长1832.9 c M,相邻标记间平均距离为0.66 c M。在此图谱基础上采用复合区间作图法（CIM）,检测到3个农艺性状的24个QTL。其中11个株高QTL分别位于A01、A06、A07、A08、A10和C06染色体,单个QTL解释5.00%~15.26%的表型变异;7个第1分枝高QTL分别位于A06、C05和C06染色体,单个QTL解释5.04%~12.99%的表型变异;6个分枝数QTL分别位于A03、A07、C01、C04和C06染色体,单个QTL解释5.95%~8.14%的表型变异。将156个拟南芥株高相关基因、10个拟南芥第1分枝高相关基因和148个拟南芥分枝数相关基因与QTL对应置信区间序列进行同源比较分析（E〈1E–20）,分别找出了20个株高候选基因、3个第1分枝高候选基因以及12个分枝数候选基因。2个环境中在A07染色体上重复检测到的QTL置信区间检测到与株高相关的候选基因ATGID1B/GID1B和WRI1,A08染色体上重复检测到的QTL置信区间检测到SLR/IAA14和AXR2/IAA72个与株高相关的候选基因。在具有部分置信区间重叠的q2013FBH-C05-1和q2014FBH-C05-2区间均检测到第1分枝高候选基因PHT1;8,在A03和C06染色体上的QTL置信区间内,分别检测到4个分枝数候选基因,匹配E值介于0~3E–56之间。

甘蓝型油菜苗期耐旱性综合评价与耐旱性鉴定指标筛选

我国油菜生产经常遭受干旱胁迫而影响产量和品质,综合评价油菜种质资源的耐旱性,筛选耐旱种质,确定耐旱性鉴定指标,是耐旱新品种培育和耐旱机理研究的基础性工作。本研究利用229份甘蓝型油菜种质资源,在苗期设置干旱胁迫组和正常灌溉(对照)组,测定地上和地下部鲜重和干重及叶片过氧化物酶活性、丙二醛含量、脯氨酸含量、可溶性蛋白含量、可溶性糖含量和相对含水量10个性状,采用耐旱系数、聚类分析、隶属函数、主成分分析和灰色关联度分析等方法对其耐旱性进行综合评价。结果显示,苗期干旱胁迫使甘蓝型油菜幼苗地上和地下部干重和鲜重及叶片相对含水量和可溶性蛋白含量显著降低,使叶片过氧化物酶活性、丙二醛含量、可溶性糖含量和脯氨酸含量显著升高,而地下部干重在正常灌溉组与干旱胁迫组之间差异不显著。229份种质资源划分为8个类群,各类群表现出不同的耐旱特性。RR002、9801C、炎81-2、07037、浙油758和09-P64-1为耐旱材料,11-P30、CY16PXW-35、08-P35、09-P36、甲972和A148为干旱敏感材料。地上部鲜重、叶片脯氨酸含量和可溶性糖含量可作为甘蓝型油菜苗期综合耐旱性快速、简便、准确的鉴定指标。

利用mRNA差异显示技术寻找甘蓝型油菜黄籽基因

以两组不同来源的甘蓝型黄籽油菜近等基因系为材料,利用mRNA差异显示技术对90对随机引物和锚定引物组合进行筛选,获得1个能稳定重复出现的差异cDNA片段。以该差异片段为探针经Northern杂交验证了上述结果,推测该差异片段可能和种皮色泽差异形成有关。对该差异片段进行了克隆、测序,并根据此序列设计了2个嵌套特异引物,利用PCR-Walking技术延伸该差异片段,对该延伸序列进行克隆、测序及序列同源性分析。同时对mRNA差异显示技术应用过程中的相关问题进行了探讨。

甘蓝型油菜种子发芽率QTL定位及相关生理性状

利用GH06×P174组合衍生的183个重组自交系进行种子发芽率遗传分析及种子发芽期间种子生理性状分析。用复合区间作图法对在室温下保存两年的种子(STY)、保存1年的种子(SOY)与新收获种子(FS)发芽率进行QTL定位。另外对保存两年的种子及新收获的种子萌发期间脂肪酶活性、电导率、还原糖含量、总糖含量及根系活力进行了测定,并对结果进行分析。结果表明3批种子的发芽率QTL位点各不相同,保存两年的种子在第9、14、17条连锁群上分别检测到1个位点,保存1年的种子在第5、9条连锁群上各检测到1个位点,新收获的种子在第4、18条连锁群上分别测检到1个位点。研究发现,3批种子的发芽率相关性不显著,发芽率差异达到极显著水平,同时保存不同年份种子的发芽率QTL各不相同,这表明甘蓝型油菜发芽率受很多不同因素所控制。保存两年及新收获种子的发芽率与电导率之间的相关性均达到极显著负相关,表明可以通过电导率的测定估测发芽率,电导率的研究对种子发芽率的研究具有重要意义。

白菜型油菜黄子资源的初步遗传研究

对随机选取的国内外22份黄子白菜型油菜和22份褐子白菜型油菜进行了种皮色泽的显隐性关系鉴定、黄子性状的等位性测验以及遗传多样性分析。结果表明,黄子白菜型油菜与褐子白菜型油菜配组的杂交组合中,部分组合的F1种皮色泽呈现父本的种皮色泽,表现出花粉直感现象;自然界中存在多种白菜型油菜黄子类型,鉴定出的3种黄子白菜型油菜与褐色白菜型油菜的F2种皮色泽均为褐色,表明黄子性状对于褐子性状为隐性;分子标记方差分析结果显示,白菜型油菜的生长习性所解释的遗传变异大于种皮颜色所解释的遗传变异,表明国外不同生长习性的黄子白菜型油菜资源可用于国内黄子白菜型油菜遗传基础的拓宽。

芸薹属A,B和C基因组之间关系研究进展

芸薹属A,B和C基因组之间的亲缘关系近年来取得了很大进展,大量细胞遗传学和分子生物学的研究结果表明:A和C基因组之间的亲缘关系较A和B基因组以及B和C基因组之间更为接近。A,B和C基因组之间的比较基因组结果表明:这3个基因组是由更加原始物种进化而来的。在芸薹属基因组演化过程中发生了大量的染色体变异,如重复、缺失、重排等,从而造成了现在不同基因组之间的差别。最后,对芸薹属不同基因组和拟南芥基因组之间的亲缘关系进行了综述。

甘蓝型油菜角果皮叶绿素含量的QTL分析

利用甘蓝型黄籽油菜GH06和甘蓝型黑籽油菜P174为亲本，通过单粒法连续自交6代构建重组自交系群体，进而构建的遗传连锁图谱，对2007年和2008年群体中每个株系的角果皮叶绿索含量进行QTL分析。复合区间作图法分析结果共检测到9个QTL，单位点贡献率在5．75％-10．82％之间，其中在第7连锁群有QTL重叠的区域。本研究认为油菜角果叶绿素含量属于典型的数量性状，受环境影响很大，与这些QTL紧密相关的分子标记可以对油菜角果叶绿素及其相关光合性状的研究奠定基础。