地方柴鸡中J亚群禽白血病与马立克氏病的混合感染

2008年9月,山东省菏泽市某柴鸡养殖专业户6 000只鸡80日龄时开始发病,至120日龄时死亡率高达15%。病鸡颜面苍白,机体进行性消瘦,瘫痪,最后衰竭死亡。部分鸡只可见单侧肢体麻痹症状和皮肤型肿瘤。对66份采自发病鸡群的血清及新生羽毛囊进行血清学检测。琼脂扩散试验结果显示所采的66份待检羽髓抗原MDV阳性率为59.09%,血清中MDV抗体阳性率为65.16%,抗原、抗体双阳性率为37.88%。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测鸡血清中ALV-J、REV抗体,结果显示ALV-J抗体阳性率为7.58%,REV抗体检测全部呈阴性。剖检病鸡可见内脏器官普遍肿大,肝、脾、肾表面及切面有大小不等的灰白色肿瘤样结节。病理组织学观察肿大的器官和组织内都有不同程度的淋巴细胞增生,并可在肝、脾、肾、腺胃等组织内同时观察到淋巴细胞样瘤细胞和髓样瘤细胞2种典型的肿瘤灶。免疫组织化学检测结果表明,发病鸡组织内同时存在MDV和ALV-J抗原的阳性信号。PCR检测结果显示6只来检病鸡MDV和ALV-J均呈阳性,都扩增出相应的条带,REV未扩增出任何条带,PCR呈阴性。以上结果表明地方柴鸡鸡群中存在MDV和ALV-J的共感染,提醒我们应当注意地方柴鸡肿瘤性疾病的预防和净化工作。

商品蛋鸡成髓细胞瘤、血管瘤型J亚群白血病病毒特性的研究

2007年7月山东某蛋鸡场150日龄海兰褐蛋鸡发病，前期经病理学和免疫组织化学检测证明和ALV—J密切相关。取4只病鸡的肝组织处理后接种鸡胚成纤维细胞（CEF）培养，用ALV—J单抗G2-3进行间接免疫荧光检测，结果呈现强阳性，将反应为阳性的4株病毒分别命名为WS0701、WS0702、WS0703和WS0704；根据ALV-J原型株HPRS-103的序列设计1对针对外源性ALV—J的引物P1和P2，提取阳性CEF基因组DNA作为模板，PCR扩增后，得到长度为924bp的片段；PCR扩增产物测序结果显示，与HPRS-103的同源性为95．0％～97．5％，与国内分离株的同源性为92．0％～95．9％；遗传变异分析结果表明成髓细胞瘤型、血管瘤型ALV-J与国内毒株的同源性较远，而与HPRS-103的同源性最近，这说明ALV—J在蛋鸡体内复制的过程中有返祖现象，并呈现了新的肿瘤学特征。

弓形虫TgROP21基因克隆及生物信息学分析

PCR扩增弓形虫棒状体蛋白21(Tg ROP21)全长基因序列,利用Signa IP和TMHMM在线网站预测分析其信号肽、跨膜区;DNAStar软件分析其亲水性、抗原指数;联合运用Ex PASY和PRODATA在线网站对Tg ROP21的功能域及三级结构进行建模。PCR产物可见1条2 022 bp左右的片段,与预期片段大小相同。成功预测出Tg ROP21的信号肽、跨膜区、亲水性、抗原指数、功能域和三级结构。

山东省肉种鸡群三种家禽肿瘤性疾病流行病学调查

为调查山东省家禽肿瘤性疾病的流行情况,本研究以血清学、病理组织学、免疫组织化学、病原学等检测手段,在山东省境内17家AA种鸡场进行检测。血清学试验结果显示:马立克氏病病毒(MDV)平均抗原阳性率为1.87%;禽白血病病毒J亚群(ALV-J)和网状内皮组织增生症病毒(REV)平均抗体阳性率分别为9.52%和39.78%;双重及三重感染,MDV+ALV-J、MDV+REV、ALV-J+REV及MDV+ALV-J+REV感染率分别为1.12%、1.21%、3.92%和0.65%。对57羽疑似肿瘤病的病鸡检测显示:MDV、ALV-J和REV的抗体阳性率分别为19.3%、47.37%和57.89%;MDV+ALV-J、MDV+REV和ALV-J+REV的双阳性率分别为1.75%、3.5%和19.3%;无三重感染。病理组织学观察显示:病鸡体内既有各病毒引起的单纯肿瘤,也有双重肿瘤共存的现象。免疫组织化学检测显示,MDV、ALV-J和REV抗原阳性信号在病鸡中的比例分别为38.6%、54.39%和28.07%。PCR检测结果表明:MDV、ALV-J和REV的阳性率分别为43.86%、64.91%和33.33%;MDV+ALV-J、MDV+REV、ALV-J+REV和MDV+ALV-J+REV阳性率分别为15.79%、10.53%、12.28%和7.02%。本研究结果表明,山东省境内AA肉鸡群中仍存在较高的肿瘤性病毒感染率。

提取陈旧阳性血膜疟原虫DNA方法的研究

目的建立一种能够提取陈旧阳性血膜疟原虫DNA的方法,为疟原虫基因溯源研究奠定基础。方法应用DNA抽提试剂盒(QIAampDNA Mini Kit)改良后提取41份吉氏染色镜检阳性血膜的疟原虫DNA,并与Chelex-100和Na2HPO4法进行比较。巢式PCR扩增疟原虫SSU r RNA基因片段,鉴定疟原虫虫种。PCR结果进行测序和序列比对,统计分析20世纪80年代与近10年血膜、不同血膜处理方法以及不同质量血膜的PCR阳性检出率差异。结果改良试剂盒法PCR结果总阳性检出率为70.7%(29/41)。80年代和近10年血膜PCR阳性检出率分别为78.6%(11/14)和66.7%(18/27),两组间差异无统计学意义(χ2=0.63,P>0.05)。经去油、脱色处理和未经处理组血膜的PCR阳性检出率分别为62.5%(15/24)和82.4%(14/17),两组间差异无统计学意义(χ2=1.89,P>0.05)。质量较好和较差血膜的PCR阳性检出率分别为93.3%(28/30)和9.1%(1/11),两组间差异有统计学意义(χ2=27.59,P<0.01)。测序结果表明扩增目的片段与预期结果一致。Chelex-100和Na2HPO4法PCR未能扩增出特异性目的条带。结论试剂盒(QIAampDNA Mini Kit)改良法提取80年代血膜疟原虫DNA可获得较高PCR阳性检出率,且染色剂和镜检油渍对血膜疟原虫DNA提取效果无明显影响。

巢式PCR技术在输入性卵形疟诊断中的应用研究

目的应用巢式PCR扩增小亚单位核糖体核糖核酸(18S r RNA)基因确诊卵形疟原虫感染。方法采集2012-2013年山东省疟疾患者全血和滤纸血样,吉氏染色镜检观察血膜疟原虫形态并鉴定虫种。提取血样中DNA,根据疟原虫18S r RNA基因以属和种特异性引物进行巢式PCR扩增,筛查卵形疟阳性标本并进行测序验证。结果2012和2013年山东省共筛查到7例输入性卵形疟原虫感染病例。巢式PCR扩增7份血样均在800 bp处出现卵形疟原虫特异性单一条带,Blast比对表明产物序列与Gen Bank卵形疟参考序列一致。结论经巢式PCR方法确诊了2012和2013年山东省7例输入性卵形疟病例。

新生儿及婴儿TORCH感染血清学检测分析

目的了解青岛地区新生儿及婴儿TORCH感染状况和感染特点。方法应用间接化学发光免疫分析法(CLIA)检测1 196例新生儿和婴儿血清中的TORCH特异性抗体,并进行统计分析。结果受检患儿中TORCH-IgM阳性率为1.67%,其中以CMV和HSV感染为主;患儿中TORCH-IgG抗体阳性率为99.16%,其中以CMV感染最常见,阳性率为94.31%;患儿混合感染率达到93.31%,以HSV和CMV混合感染为最多,阳性率达85.45%;新生儿及婴儿IgG抗体检测均以CMV-IgG抗体阳性率最高,分别为96.28%、82.76%;男性和女性患儿CMV-IgG阳性率均为最高,分别为94.36%、94.27%。结论青岛地区TORCH感染以CMV、HSV感染及二者混合感染为主,既往感染阳性率较高,新近感染阳性率较低,新近感染患儿并发症主要是呼吸系统和消化系统疾病,因此,加强新生儿和婴儿TORCH抗体检测筛查,对辅助临床鉴别和治疗具有重要的意义。

不同粒度黄芪粉对肉鸡抗氧化性能的影响

本试验旨在研究不同粒度黄芪粉对肉鸡抗氧化性能的影响。选用1日龄、健康、体重接近的AA肉仔鸡120只，随机分为5个处理，处理I为对照组，饲喂常规基础日粮；处理Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、V为试验组，分别饲喂在对照组日粮基础上各添加0．2％不同粒度的黄芪粉A（50目）、B（100目）、C（超微细200目）、D（超微细400目）。结果表明：日粮中添加不同粒度的黄芪粉时，与对照组相比，均能显著的提高（P〈0．05）肉鸡血清SOD、GSH—Px活性和降低MDA含量（P〈0．05）。结论：肉鸡日粮中添加黄芪粉能够有效改善机体的抗氧化水平。

siRNA干扰DNALI1基因对HEK-293细胞增殖与迁移的影响

文章探讨了siRNA干扰DNALI1基因对HEK-293细胞增殖、迁移的影响。通过培养HEK-293细胞株,分别转染siRNA DNALI1组(DNALI1-homo-66组、DNALI1-homo-426组与DNALI1-homo-777组)和对照组。siRNA DNALI1组细胞中DNALI1 mRNA表达量均低于对照组,三个干扰组中DNALI1-homo-66组干扰效率最高,差异均具有统计学意义(P<0.05);与阳性对照组和阴性对照组相比,siRNA DNALI1组细胞转染24-48h细胞增殖能力明显减弱,差异均具有统计学意义(P<0.05)。在细胞水平可通过RNA干扰特异性抑制DNALI1基因来抑制细胞的增殖和迁移能力,为研究DNALI1基因在细胞中的作用机制奠定了基础。

感染J亚群禽白血病病毒的蛋鸡群中检测出B亚群禽白血病病毒

通过血清学、病理学以及病毒学检测,首次在国内从感染ALV-J的海蓝白商品蛋鸡群中分离到B亚群禽白血病病毒（ALV-B）。ELISA检测该鸡场血清样品（92份）显示,ALV-A/B型抗体阳性率为16.3%,ALV-J抗体阳性率为13%,其中有1只鸡呈现抗体双阳性。取3只表现临床症状病鸡做病理组织学观察,在肝脏同一位置发现淋巴细胞样瘤细胞和髓细胞样瘤细胞增生灶,其它组织器官（除脑、神经和法氏囊）也有不同程度的两种瘤细胞增生。根据文献设计合成ALV-A、ALV-B、ALV-J、MDV和REV的特异性引物。取该3只病鸡肝脏病料研磨接种DF-1细胞,培养7-10天后提取培养细胞DNA,PCR扩增获得1 100bp的ALV-B特异性片段和924bp的ALV-J特异性片段,其中有1只鸡为ALV-B和ALV-J双阳性,而ALV-A、MDV、REV的PCR结果为阴性,因此获得ALV-B和ALV-J各两株分离株。对ALV-B、ALV-J扩增序列进行遗传进化树分析表明,两ALV-B分离株与其代表株的同源性分别为92.8%和94.7%;两ALV-J分离株与英国原型株同源性分别为96.9%和91.5%,与美国原型株同源性为85.9%和81．5％，与国内分离毒株同源性在87．0％～98．7％之间。本研究在国内分离到ALV—B毒株，并证实了ALV-B、J在同一只鸡体内的混合感染，应引起养禽业及相关研究部门的高度重视。

弓形虫棒状体蛋白ROP16的研究进展

棒状体蛋白16(ROP16)是弓形虫棒状体蛋白家族成员,其蛋白结构存在丝氨酸、苏氨酸激酶区,是弓形虫入侵过程中的重要毒力因子。ROP16可分泌到宿主细胞核,能磷酸化宿主细胞的转录活化因子STAT3/6,干扰宿主细胞信号通路传导,在弓形虫入侵宿主细胞过程中发挥着重要作用。本文对弓形虫ROP16的发现、功能、免疫保护性等方面进行综述。

刚地弓形虫toxofilin蛋白的研究进展

Toxofilin是刚地弓形虫棒状体蛋白家族成员,但该蛋白有一定的特殊性,其结构中不存在棒状体蛋白典型丝氨酸、苏氨酸激酶区。Toxofilin分泌到宿主细胞质中,能与磷酸脂酶2C(PP2C)、肌动蛋白(actin)相互作用,形成toxofilin-actin-PP2C三聚体复合物,被酪蛋白激酶Ⅱ(CKⅡ)和PP2C激活发生磷酸化,在弓形虫入侵细胞过程中发挥重要作用。本文综述了弓形虫toxofilin的发现及其功能和免疫保护性等方面的研究进展。

弓形虫ROP21基因的原核表达与免疫学鉴定

目的原核表达弓形虫棒状体ROP21基因,并对rROP21蛋白进行免疫学鉴定。方法根据已发表的ROP21基因序列设计引物,通过RT-PCR方法扩增弓形虫RH株的ROP21基因。将ROP21基因克隆到原核表达载体pET-28a(+)后转化大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达目的蛋白,纯化后进行SDS-PAGE分析、Western blot及IFA分析。结果经PCR和酶切鉴定,成功构建重组表达载体。重组质粒转化BL21(DE3)后经IPTG诱导,重组蛋白(rROP21)以包涵体形式高效表达,分子质量单位约为45ku。Western blot显示重组rROP21蛋白能被his标签抗体及弓形虫病患者血清识别。用rROP21免疫小鼠,获得滴度为1∶104的抗体血清。IFA显示弓形虫速殖子体内存在ROP21蛋白。结论构建的重组质粒pET28a-ROP21表达的弓形虫rROP21具有抗性,可作为血清学诊断候选抗原,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。

pcDNA3-HBsAg-p30-ROP2真核表达载体的构建与鉴定

目的构建pcDNA3-HBsAg-p30-ROP2多基因重组表达载体,并对其进行初步鉴定。方法根据重组体pcDNA3-p30-ROP2酶切位点和乙型肝炎表面抗原(HBsAg)基因序列等因素设计合成引物,扩增HBsAg目的基因片段,再应用酶切、连接等分子生物学技术将HBsAg目的基因克隆至pcDNA3-p30-ROP2表达载体中。应用聚合酶链反应(PCR)初筛,再采用酶切、测序等技术对构建的重组表达载体pcDNA3-HBsAg-p30-ROP2进行鉴定。结果 PCR扩增出HBsAg基因片段,构建了pcDNA3-HBsAg-p30-ROP2多基因真核表达载体。PCR与酶切结果显示,该基因片段大小均与理论值相符;测序结果显示该重组表达载体包含了p30-ROP2和HBsAg目的基因的完整序列。结论成功构建了多基因重组表达载体pcDNA3-HBsAg-p30-ROP2,为进一步研究多基因核酸疫苗奠定了基础。

诱发血管瘤型J亚群禽白血病病毒gp85基因的克隆与表达

2007年7月至11月,中国开产前后的商品海兰褐蛋鸡群大面积暴发血管瘤,造成巨大经济损失。将病料接种DF1细胞,通过PCR和间接免疫荧光(IFA)确定此次暴发的血管瘤为J亚群白血病病毒(ALV-J)感染引起。从患病鸡群中分离到5株ALV-J(前4株已经报道),将第5株病毒命名为WS0705。为研究该毒株抗原性的特点,用PCR方法扩增出gp85基因,并克隆进pMD18-T载体进行测序。氨基酸系统进化树分析显示WS0705与英国ALV-J原型毒株HPRS-103同源性最高。从已构建的质粒pMD18-T-WS0705gp85中酶切回收gp85基因,构建重组转移载体pFastBacH Tb-WS0705gp85。利用Bac-to-Bac表达系统获得了重组杆状病毒rBac-WS0705gp85。间接免疫荧光和Western blot检测WS0705gp85基因的表达产物。间接免疫荧光显示,构建的重组杆状病毒感染的Sf9细胞呈现明显的强阳性反应;Western blot分析,重组病毒感染的Sf9细胞蛋白显示出约35kD的阳性条带。结果表明,WS0705gp85基因在Sf9细胞中得到良好的表达,并且其编码产物完全可以被外源性ALV-J的特异性单抗JE9识别,进一步证明本次暴发血管瘤的病原为ALV-J,并为进一步开发ALV-J相关诊断产品奠定了基础。

弓形虫GRA6基因的重组、表达及鉴定

目的构建弓形虫致密颗粒蛋白6(GRA6)基因重组质粒并在大肠埃希菌中进行表达。方法根据弓形虫GRA6基因序列设计并合成引物,用PCR方法从弓形虫基因组DNA中扩增GRA6基因片段,扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定后,再克隆到pGEX-4T载体中,重组质粒经限制性内切酶BamHI、EcoRI酶切鉴定并测序后,将重组质粒转化大肠埃希菌BL21后并用IPTG诱导表达,产物经SDS-PAGE分析并纯化,以Western blot分析其反应原性。结果以弓形虫DNA为模板扩增GRA6基因片段,经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物大小为693bp,与理论值相符;重组质粒经酶切鉴定构建成功,测序结果与GenBank上弓形虫RH株GRA6序列AF239283.1同源性100%;重组质粒转化菌经IPTG诱导后表达的GRA6融合蛋白分子质量单位约为52ku,与GST-GRA6的理论分子质量相符,该融合蛋白可被GST标签抗体识别。结论成功重组了弓形虫GRA6基因,表达蛋白具有反应原性,为弓形虫诊断抗原试剂盒的制备奠定了基础。

弓形虫ROP21诱饵质粒的构建与自激活鉴定

目的筛选与弓形虫ROP21相互作用的宿主蛋白。方法构建弓形虫ROP21基因的三个诱饵载体,通过酵母双杂交技术分别对其在Y2H Gold酵母菌中的毒性和自激活进行鉴定。提取弓形虫RNA并进行反转录,采用RT-PCR方法扩增得到弓形虫ROP21全长序列,根据其不同功能区构建全长或部分序列诱饵质粒,测序后分别命名为pGBKT7-ROP21、pGBKT7-LC和pGBKT7-ST。将重组的诱饵载体转化到Y2H酿酒酵母菌,在营养缺陷型培养基上观察该重组诱饵载体的毒性和自激活现象。结果发现三个质粒转化酵母菌后,pGBKT7-ROP21和pGBKT7-ST存在自激活现象,而pGBKT7-LC转化酵母菌不存在,因此其可以作为酵母双杂交筛选的诱饵质粒。结论为进一步运用酵母双杂交技术筛选与弓形虫ROP21互作的宿主蛋白奠定了基础。

刚地弓形虫微线蛋白16基因片段原核表达、纯化及免疫反应性分析

目的原核表达刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)微线蛋白16(micronemal protein 16,Tg MIC16)的3个基因片段,并分析3个重组蛋白的免疫反应性。方法参照Gen Bank中Tg MIC16基因序列,根据功能活性区将其分为3个片段(M16D1、M16D2、M16D3),分别设计引物,以刚地弓形虫RH株速殖子RNA为模板,通过RT-PCR扩增,获得预期的3个DNA片段,双酶切后连接至原核表达载体p ET-32a(+),将重组质粒转化入大肠埃希菌(Escherichia coli)TOP10,经PCR、双酶切筛选阳性质粒,测序确认后转化至E.coli Rosetta,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测表达产物。重组蛋白经镍柱纯化后,分别以抗组氨酸(His)单抗和弓形虫感染兔血清为一抗,Western blotting分析其免疫反应性。结果 Tg MIC16 3个基因片段的RT-PCR扩增产物分别为1 806、1 290、855 bp。双酶切和测序结果显示,3个Tg MIC16片段的重组表达质粒构建成功。SDS-PAGE分析结果显示,3个重组蛋白成功表达,且均为以包涵体的形式表达,相对分子质量(M_r)分别为88 000、68 000、52 000。Western blotting分析结果显示,3个纯化的表达蛋白均能被抗His单抗和弓形虫感染兔血清识别。结论成功构建并表达Tg MIC16的3个功能活性区,且3个重组蛋白均表现出良好的免疫反应性。

pEGFP-N1-HBsAg-p30-ROP2真核表达载体的构建及其在293T细胞中的表达

目的构建pEGFP-N1-HBsAg-p30-ROP2重组表达载体并进行293T细胞的转染表达。方法根据pcDNA3-HBsAg-p30-ROP2重组质粒设计引物,进行PCR扩增,获得HBsAg-p30-ROP2融合基因并进行酶切,酶切片段与pEGFP-N1载体连接,构建pEGFP-N1-HBsAg-p30-ROP2真核表达载体,酶切和测序鉴定后转染293T细胞,采用荧光、Western blot和ELISA检测其蛋白表达效率;分别用P30单抗腹水、ROP2鼠源多抗、乙肝患者血清进行ELISA,检测融合蛋白的免疫反应性。结果 PCR扩增HBsAg-p30-ROP2基因片段约2 600bp,与理论值相符。构建的重组质粒pEGFP-N1-HBsAg-p30-ROP2经双酶切获到约4 700bp和约2 600bp的两条片段,与预期相符。对重组载体测序,HBsAg基因的252位C→A,345位T→C,ROP2基因的695位A→T,且3个碱基突变均为同义突变。免疫荧光法检测pEGFP-N1-HBsAg-p30-ROP2转染成功并正确表达,细胞蛋白浓度2.40mg/ml。提取的融合蛋白能被弓形虫p30单抗腹水、ROP2鼠源多抗和乙肝患者血清识别。结论成功构建pEGFP-N1-HBsAg-p30-ROP2重组表达载体,并在293T细胞中过表达,表达蛋白具有免疫反应性,为乙肝和弓形虫联合疫苗的研制奠定了基础。