罗非鱼嗜水气单胞菌的分离鉴定

从广西某江网箱养鱼场的发病或濒死罗非鱼中分离到8株呈β溶血的革兰氏阴性杆菌,符合嗜水气单胞菌的特征,致病性试验结果显示8株分离菌均具有较强的致病性,均能致死小白鼠和罗非鱼,并都能产生较强的毒素致死小白鼠;8株分离菌对环丙沙星、氟哌酸、氯霉素、庆大霉素等高度敏感。

新城疫病毒广西强毒株的分离与鉴定

从广西某规模化鸡场两个鸡群病死雏鸡中分离到2株有血凝性的病毒,这2株病毒的血凝性均能被新城疫标准阳性血清抑制和中和,经过血凝(HA)试验、血凝抑制(HI)试验、血清中和试验和RT PCR检测结果,确定为新城疫病毒。2株病毒的鸡胚平均死亡时间(MDT)分别为52和54h,脑内致病指数(ICPI)分别为1 975、1 875;鸡胚半数致死量(ELD50)分别为:10-9 38/0 1mL、10-9 68/0 1mL,实验结果证明该2株病毒为新城疫病毒强毒株。

应用聚合酶链反应扩增鸡传染性喉气管炎病毒TK基因的研究

根据鸡传染性喉气管炎病毒 (ILTV)TK基因的核苷酸序列设计并合成 1对引物 ,用该引物对 4株不同的ILTV进行PCR扩增。结果全部ILTV毒株均获得与试验设计相符的 64 7bp的扩增片段 ,而对其它 6种禽病原体的扩增结果均为阴性 ;敏感试验表明 ,该引物能检出 10pg的ILTVDNA。

10株新城疫病毒广西分离株HN蛋白基因的克隆与序列分析

根据基因库(GenBank)新城疫病毒(NDV)的HN基因序列设计了2对特异性引物,应用RT-PCR技术对广西在2000～2003年暴发新城疫的鸡群中分离的10株NDV毒株的HN基因进行了扩增,扩增产物克隆并测序,拼接出10个NDV广西分离株的HN基因全序列,其序列全长均为1 713 bp,编码571个氨基酸,均有13个半胱氨酸残基.其中GX8/03有6个糖基化位点,而GX2/00、GX6/02、GX7/02和GX5/00有5个糖基化位点,GX1/00、GX3/00、GX4/00和GX9/03有4个糖基化位点.除GX5/00和GX10/03分离株外,其他8个NDV分离株在HN基因抗原位点Ⅰ发生变异,即347位由谷氨酸(E)被甘氨酸(G)替代,GX8/03分离株在HN基因抗原位点Ⅱ的495位由赖氨酸(K)替代谷氨酸(E).与11株已发表的NDV HN基因全序列相比较,其核苷酸同源性在79.6%～ 97.9%之间,推导的氨基酸同源性在87.2%～98.1%之间.

二温式PCR检测罗非鱼嗜水气单胞菌的研究

根据基因库嗜水气单胞菌的脂肪酶基因序列设计1对特异性引物,用二温式PCR对从病死罗非鱼体内分离的8株嗜水气单胞菌进行扩增。特异性结果显示该引物对8株嗜水气单胞菌均能扩增出与预期大小相一致的760bp扩增产物,而对弧菌、肠炎杆菌、禽多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌和沙门氏菌的扩增均无任何条带。二温式PCR敏感性结果表明可以检测到10pg的嗜水气单胞菌DNA模板。

应用RAPD技术分析禽多杀性巴氏杆菌广西分离株的DNA多态性

应用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术 ,以随机引物单条或成对组合的方式对 9株禽巴氏杆菌 (PM )广西分离株和 3个参考株的DNA进行了多态性分析。结果显示 ,在选用的 2 0个引物中 ,有 4对引物 (4条引物成对组合 )扩增的条带为 1～ 16条 ,其长度在 90～ 2 6 0 0bp。相似指数分析显示 ,PM广西分离株GX2与GX4的相似指数最高 ,为 0 .97;GX7与B2 6T12 0 0的相似指数最低 ,为 0 .2 1,C4 8 1标准强毒株与PM广西分离株间的相似指数为 0 .33～ 0 .6 4。表明广西当地的流行株呈现多样性 ,与PM标准强毒株存在差异。

鸡毒支原体(MG)地高辛探针的制备

从带有鸡毒支原体 (MG) 732 bp16 S r RNA DNA片段的重组质粒中回收 ,并制备出地高辛标记的 MGDNA探针。其特异性检测结果表明 ,该探针能与 MG不同毒株核酸抽提物起特异性杂交反应。而与对照 NDV、IL TV、MS、MI和 MM等病原抽提的核酸的杂交反应均为阴性。敏感性结果表明 ,该探针对 MG DNA的最低检出量为 1ng。应用该探针对人工感染 MG的 SPF鸡的咽喉棉试子进行检测 ,结果均出现杂交显色反应。表明所制备的探针用于 MG的检测是可行的。

2000-2004年间广西新城疫病毒强毒株的分离与鉴定

近年来从广西不同地区规模化鸡场的13个肉鸡群病死鸡中分离到13株有血凝性的病毒,这13株病毒的血凝性均能被新城疫标准阳性血清抑制,经过血凝(HA)试验、血凝抑制 (HI)试验和RT-PCR检测结果确定为新城疫病毒。13株病毒的生物学特性测定实验结果证明该13株病毒均为新城疫病毒强毒株。

11株新城疫病毒广西分离株P基因的克隆和序列分析

根据基因库的新城疫病毒(NDV)的磷蛋白(P)基因序列设计了1对特异性引物,应用RT-PCR技术对11个NDV广西分离株的P基因进行RT-PCR扩增和序列测定,P基因阅读框的核苷酸序列全长均为1188bp,编码395个氨基酸。核苷酸及氨基酸全序列比较分析,结果表明:11个NDV广西分离株与10个参考株的核苷酸序列同源性为81.2%～97.8%,氨基酸同源性为78.8%～97.0%。

一起鸭疫里氏杆菌病的诊治

１９９８年３月，南宁市郊某鸭场１４日龄小鸭发生以眼、鼻流浆液性分泌物，拉稀，腿软无力，伴发神经症状，以纤维素性心包炎、纤维素性肝周炎、纤维素性气囊炎等病变为特征的疫病。从病死鸭的肝、脑、心包液中分离出５株病原菌，经细菌的形态染色特性、培养特点，生化试...

雏鸡暴发绿脓杆菌病的诊治

雏鸡绿脓杆菌病是一种由条件性致病菌绿脓杆菌引起的传染病。通常细菌经免疫注射的伤口或脐带进入雏鸡体内并大量繁殖而发病，造成雏鸡大量死亡。近年来该病常有发生，造成严重的经济损失，已引起养禽业者的重视。１９９７年１１月南宁某鸡场饲养的Ｂ４蛋用雏鸡，暴发一起...

H9亚型禽流感病毒RT-LAMP可视化检测方法的建立

目的根据环介导等温扩增技术(LAMP),建立了一种适用于H9亚型禽流感病毒(AIV)的逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)快速检测方法。方法根据GenBank中的H9亚型AIV血凝素(HA)基因序列,在保守区设计了一套针对HA基因8个区域的6条特异性引物,并对反应条件进行优化。结果结果表明该方法对H3、H5、H7亚型AIV及其它禽呼吸道病原体均无扩增反应,并可通过反应液是否有沉淀或向反应液中加入荧光染料来对结果进行可视化观察;扩增反应只需要在常规水浴锅中进行,50min之内可完成反应;该方法对H9亚型AIV RNA的最小检测限为0.01pg,灵敏度是一步法RT-PCR方法的1 000倍。结论本研究建立的RT-LAMP方法简便、快速、灵敏、特异,适合在基层进行H9亚型AIV的快速检测。

应用多重聚合酶链反应同时检测鉴别鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡传染性喉气管炎病毒和鸡毒支原体的研究

本文建立了一种同时检测NDV、IBV、ILTV和MG 4种病原体的多重PCR技术。根据NDV、IBV、ILTV和MG的基因文库 ,设计了 4对分别与NDV、IBV、ILTV和MG某段基因序列互补的引物 ,用这 4对引物对同一样品中的NDV、IBV、ILTV、MGRVA或DNA模板进行多重PCR扩增 ,结果均同时得到了 4条特异性大小与实验设计相符的 310bp(NDV)、172 0bp(IBV)、6 47bp(ILTV)、和 732bp(MG)多重PCR扩增带 ,而对其他 6种禽病病原的PCR扩增结果均为阴性 ;敏感性测定结果表明 ,该多重PCR技术能检出 10pg的IBV、1pg的NDVRNA模板和 10pg的ILTV、1pg的MGDNA模板。

禽呼肠孤病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为建立禽呼肠孤病毒（ARV）实时荧光定量RT-PCR检测方法，将PCR扩增的σC基因片段克隆到pGM-T载体，重组质粒经筛选、鉴定、SalⅠ单酶切，得到线性化转录模板DNA，将体外转录的RNA梯度稀释后作为阳性模板，用于标准曲线的制定。根据S1基因σC结构蛋白基因保守区域序列设计了1对特异性引物，以体外转录的RNA作为标准品，应用SYBRGreenI染料法建立了检测ARV的一步法实时荧光定量RT-PCR方法。特异性、敏感性和重复性试验结果表明，制作的标准曲线定量浓度范围宽，比常规的RT-PCR敏感1×10^3倍，可检测到5．2×10^2个拷贝的标准品RNA，与NDV、IBDV、MG均不反应；从攻毒鸡的关节组织中可以检测到病毒，病毒含量为1×10^5～1×10^7个拷贝／μL.表明，建立的实时荧光定量RT-PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点，可用于ARV的检测。

禽呼肠孤病毒广西分离株σ_3基因的克隆和表达

采用RT_PCR技术扩增禽呼肠孤病毒广西分离株R1σ3基因,将σ3基因克隆至PGEX_4T_1载体上,测序结果表明插入的片段为σ3目的基因。切下目的基因σ3,重组到含有谷胱甘肽(GST)的融合蛋白质粒表达载体PGEX_4T_1,获得重组质粒经PCR酶切以及序列分析鉴定,表达σ3基因插入的位置,大小和阅码框架均正确,表明成功构建了融合表达载体PGEX_R1_σ3。构建好的重组质粒,经1mmol/LIPTG诱导,在大肠杆菌DH5α中得到了表达。融合蛋白GST_R1_σ3的分子量为60ku,以包涵体形式存在。Westernblot分析表明,融合蛋白能够与ARV阳性血清发生特异性反应,表明该重组蛋白具有良好的抗原性和特异性。

二温式多重PCR检测鉴别对虾白斑综合征病毒(WSSV)和传染性皮下及造血器官坏死病毒(IHHNV)的研究与应用

建立了一种同时检测对虾白斑综合征病毒(WSSV)、传染性皮下和造血器官坏死病毒(IHHNV)的二温式多重PCR技术。根据基因库中WSSV(AF369029)和IHHNV(NC002190)基因序列,设计了两对分别与WSSV和IHHNV某段保守基因序列互补的引物,用这两对引物对同一样品中的WSSV和IHHNV DNA模板进行多重PCR扩增,结果均同时得到了两条大小与实验设计相符的593 bp(WSSV)和356 bp(IHHNV)特异性多重PCR扩增条带,而对其他对虾疾病病原的PCR扩增结果均为阴性;敏感性测定结果表明,该多重PCR技术最低能检测到WSSV和IHHNV DNA各100 pg。用该多重PCR对400份临床病料进行检测,结果230份检出WSSV,阳性率57.5%;96份检出IHHNV,阳性率24%;56份同时检出WSSV和IHHNV,阳性率14%。18份为阴性,阴性率为4.5%。结果提示了WSSV和IHHNV广泛存在于中国南方的养殖对虾中,作者建立的二温式多重PCR可以用于这两种病毒的临床快速检测和鉴别诊断。

多重RT-PCR同时检测鉴别三种对虾病毒的研究与应用

根据基因库中对虾桃拉综合征病毒(TSV)、白斑综合征病毒(WSSV)、传染性皮下和造血器官坏死病毒(I-HHNV)的基因序列,分别设计了三对特异性引物,通过对多重RT-PCR扩增条件的优化,研究建立了可同时检测鉴别TSV、WSSV和IHHNV的多重RT-PCR。该技术对同一样品中的TSV RNA、WSSV DNA和IHHNV DNA模板进行扩增,结果均同时得到3条大小与实验设计相符的231bp(TSV)、593bp(WSSV)和356bp(IHHNV)的特异性多重RT-PCR扩增带,对其它对虾病原核酸的扩增结果为阴性。敏感性试验结果表明,该技术最低能检测到10pg TSV RNA、100pg WSSV DNA和100pg IHHNV DNA。临床检测试验结果表明,该技术对TSV、WSSV和I-HHNV的检出率明显高于传统的临床症状观察和组织病理学检查,提示该技术适用于这三种病毒的临床快速检测和鉴别诊断。

禽呼肠孤病毒地高辛探针的制备及应用

从带有禽呼肠孤病毒 (ARV)S1cDNA片段的重组质粒中回收 5 4 0bpS1cDNA片段 ,并制备出地高辛标记的ARVcD NA探针。其特异性检测结果表明 ,该探针能与ARV不同毒株核酸抽提物起特异性杂交反应 ,而与对照IBV、NDV、ILTV、MG、E .coli正常鸡胚尿囊液抽提的核酸及载体PBluescript空质粒DNA的杂交反应均为阴性 ,敏感性检测结果表明 ,该探针对ARVRNA的最低检出量为 0 .4 5ng。应用该探针对不同方法处理的病料进行检测 ,结果均出现杂交显色反应。

二温式PCR检测对虾白斑综合征病毒

本研究设计了一对能扩增大小为 30 6 bp对虾白斑综合征病毒 (WSSV)某段基因的特异性引物 ,优化建立了能快速检测 WSSV的二温式 PCR。在对包括 10 5份临床样品、10份 SPF南美白对虾组织样品和其他对虾病害病原在内的样品检测结果中 ,有 6 5份临床样品呈现 WSSV阳性 ,而 10份 SPF南美白对虾组织样品和其他对虾病害病原的 PCR结果为阴性。该二温式 PCR最低能检测到 1pg的 WSSV感染对虾组织样品总 DNA。这些结果表明 ,该 PCR具有高度的特异性和敏染性。

应用多重PCR检测鉴别对虾白斑综合征病毒和桃拉病毒

研究建立了一种可同时检测对虾白斑综合征病毒 (WSSV)和桃拉病毒 (TSV)的多重聚合酶链式反应 (多重PCR)技术。根据 WSSV和 TSV基因序列 ,设计合成了 2对分别与 WSSV和 TSV某段基因序列互补的引物 ,用这 2对引物对同一样品中的 WSSV DNA和 TSV RNA模板进行多重 PCR扩增 ,结果均同时得到了 2条特异的与实验设计相符的 30 6 bp(WSSV)和 2 31bp(TSV)多重 PCR扩增带 ,而对其他对虾病病原的 PCR扩增结果均为阴性 ;敏感性测定结果表明 ,该多重 PCR技术能检出 10 pg的 WSSV DNA和 1pg的 TSV