细胞凋亡及其基因调控

细胞凋亡及其基因调控刘士廉，郑德先（中国医学科学院基础医学研究所，北京１００００５）细胞的死亡，顾名思义，是指细胞生命活动的结束。在多细胞生物中，细胞的死亡有两种不同的形式。一种是坏死性或意外性死亡（Ｎｅｃｒｏｓｉｓ或ＡｃｃｉｄｅｎｔａｌＣｅｌｌＤｅ...

胸腺肽的研究

自60年代初以来,大量实验研究证明,胸腺不是一般淋巴组织,而是调节机体免疫的中枢性器官。它的主要生理功能包括分泌对胸腺淋巴细胞的分化。

注射用胸腺肽研究成果的推广应用

60年代实验证明胸腺是机体细胞免疫的中枢器官。我们实验室1973年开始了胸腺激素的研究,对1972年首见报道的胸腺素(ThymosinF5)的分离方法进行了验证和较大的改良,创建了脐带血E玫瑰花结检测生物活性的方法,而且通过临床协作研究,观察到它对获得性免疫功能低下症有明显的治疗效果,这些结果分别获得卫生部和北京市政府的奖励。至1979年。

重组可溶性TRAIL的表达与生物学活性

研究重组可溶性TRAIL的抗肿瘤生物学活性。采用基因分子生物学方法构建重组可溶性TRAIL的表达载体 ,建立大肠杆菌表达菌株 ,采用柱层析等方法获得纯化的重组可溶性TRAIL ;采用流式细胞术、细胞活性测定法和体内药效学实验分析重组可溶性TRAIL杀伤肿瘤细胞的生物学活性。结果表明重组可溶性TRAIL在体外可诱导人白血病细胞和肝癌细胞凋亡 ,凋亡率达5 0 %以上。中枢神经系统的肿瘤细胞对重组可溶性TRAIL不敏感。重组可溶性TRAIL在体内能显著抑制人非小细胞肺癌细胞在小鼠体内生长 ,抑制率达 70 %以上。结论为研究制备的重组可溶性TRAIL能在体内外杀死多种肿瘤细胞 ,具有显著的临床应用前景。

Bcl-2家族蛋白参与调节CD3ε和5-氟尿嘧啶介导的T淋巴细胞凋亡

目的 :研究Bcl 2家族成员在 5 氟尿嘧啶 (5 FU)和CD3ε介导的T淋巴细胞凋亡中的作用 ,阐述T淋巴细胞凋亡的分子机制 ,为相关肿瘤的治疗提供依据。方法 :用CD3ε特异的单克隆抗体 (2 0 0 μg/ml)和 5 FU(2 5 μg/ml)单独或联合刺激JK、TJK和T3JK细胞 ,诱导细胞凋亡 ,用MTS比色法检测细胞死亡率 ,用Westernblot检测Bid的表达和活化。用脂质体的方法转染细胞。结果 :CD3ε特异的单克隆抗体和 5 FU分别单独处理TJK细胞 ,都能诱导其凋亡并伴随Bid的活化 ,二者联合使用能显著增加TJK细胞凋亡和Bid的活化。Bcl 2过表达可明显降低TJK细胞对 5 FU的敏感性。结论 :Bcl 2家族成员参与CD3ε和 5 FU诱导的T淋巴细胞凋亡的调节 ,Bcl 2过表达能显著抑制T淋巴细胞对 5 FU的敏感性。

人蛋白酶抑制因子α_2－巨球蛋白的分离、纯化与鉴定

人蛋白酶抑制因子α_２－巨球蛋白的分离、纯化与鉴定郑德先，侯充，赵清正，赵玫，王萍，许成素，刘士廉（中国医学科学院，中国协和医科大学基础医学研究所，北京１００００５）人血浆蛋白酶抑制因子α２－巨球蛋白（α２－Ｍ）能与癌基因ｓｉｓ的产物ｐ２８蛋白及其它...

抗肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体受体死亡受体5嵌合抗体的构建及其真核表达

目的构建以人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)受体死亡受体5(DR5)为抗原的鼠/人重组嵌合抗体。方法采用基因工程技术,扩增和克隆抗DR5嵌合抗体的轻、重链表达载体,共转染二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢细胞(CHO-dhfr-),筛选稳定分泌表达抗DR5嵌合抗体的细胞株。采用ELISA和Western bloting法鉴定抗体的人源性和抗体-抗原结合活性,四唑盐/吩嗪硫酸甲酯比色法检测抗体的生物学活性。结果获得了稳定表达和分泌抗人DR5的嵌合抗体(anti-DR5mV-hH)的重组细胞;与人DR5蛋白具有高的特异性结合活性;能使体外培养的人髓性白血病Jurkat细胞和人结肠癌HCT116细胞的存活率分别下降到73.15%和77.30%。结论抗DR5嵌合抗体anti-DR5mV-hH具有抗肿瘤活性,为发展人源化抗体药物的研究奠定了基础。

白血病细胞系中B-Raf与Raf-1的表达及活性

目的研究白血病细胞及正常人外周血淋巴细胞中的 B- Raf和 Raf- 1表达水平及激酶活性。方法利用 Western印迹法检测 B- Raf和 Raf- 1表达水平，利用免疫沉淀及 Western印迹法检测 Raf- 1及 B- Raf的激酶活性。结果 Raf- 1在白血病细胞及正常人外周血淋巴细胞中均有表达 ,表达水平基本相似，其激酶活性较低； B- Raf仅在白血病细胞中表达，且在 Jurkat和 K562细胞中的表达水平较高，其激酶活性也较高。结论在白血病细胞中， B- Raf的高表达及活化可能是白血病发病的机制之一。

生长激素分泌过多患者外周血淋巴细胞CD2 mRNA的表达

应用ＲＮＡ斑点杂交法，测定了１２例生长激素（ＧＨ）分泌过多患者及１０例正常人外周血淋巴细胞ＣＤ２ｍＲＮＡ的表达，发现患者ＣＤ２ｍＲＮＡ的表达较之正常人有显著下降，提示ＧＨ分泌过多对Ｔ淋巴细胞ＣＤ２ｍＲＮＡ的表达有显著影响。此结果为研究内分泌系统产生的肽类激素对免疫系统的影响提供了新的资料。

可溶型猪CD2的分离纯化及其生物化学性质的研究

本文报告可溶型猪E受体的分离纯化及其生物化学性质的研究结果。以羊抗猪CD2的抗体制备亲和层析柱,从猪血清中分离反向玫瑰花实验和免疫双扩散均为阳性的组分后,再经制备SDS—PAGE和电泳洗脱纯化,得到两个猪可溶型CD2(sCD2)分子。其分子量分别为60和29KDa。sCD2在SDS—PAGE和IEF—PAGE 中均呈现单一区带,其等电点分别为6.6和5.5,酶联免疫分析所呈阳性反应。比较研究发现sCD2与膜结合型CD2的生物化学性质不同,前者对一定剂量范围内的ConA 或PHA 诱导的猪外周血淋巴细胞增强具有抑制作用,这种抑制效应具有量效关系,而后者与T 细胞激活有关,文中对两型CD2生物学活性的差别以及sCD2的生物学意义进行了讨论。

DR4死亡结构域结合蛋白的初步研究

目的克隆DR4死亡结构域的结合蛋白,为进一步研究DR4诱导细胞凋亡的信号传递途径提供条件。方法以TRAIL(TNF-relatedapoptosisinducingligand)死亡受体DR4的死亡结构域(DR4DD)为钓饵,采用酵母双杂交系统筛选人白细胞MATCHMAKERcDNA文库。以DNA自动分析仪测定核苷酸序列,采用计算机软件分析核苷酸的同源性及功能结构域。并用免疫共沉淀方法分析人类甲酰肽受体1(formylpeptidereceptor-like1,FPRL1)在哺乳动物细胞内是否与DR4CD(thecytoplsmicdomainofDR4)特异性地结合。结果获得了两个阳性克隆pADB1和pADB2。DNA序列分析及同源性比较表明,pADB1的插入片段与人FPRL1的mRNA序列具有97%的同源性。pADB2的插入片段与GeneBank中的已知序列无同源性。免疫共沉淀结果表明FPRL1在哺乳动物细胞内可与DR4CD特异性地结合。结论FPRL1可与DR4的死亡结构域特异性结合,推测FPRL1与DR4的结合可能在DR4介导的细胞凋亡信号传导途径中发挥一定的作用。

正常育龄和妊娠妇女血清游离型E受体水平的初步观察

LT淋巴细胞E受体可呈游离状态(可溶性)存在于血清中,其水平变化与人生理状态及疾病具有一定相关性。本实验采用刘士廉等证明人和猪E受体有同源性的基础上建立的以绵羊抗猪E受体抗血清IgG双抗体夹心酶标法(ELISA),洲定妊娠妇女血清游离E受体水平的变化,以正常育龄妇女、逾预产期及妊娠高血压综合征妇女的检测结果为对照,探索妊娠与免疫的关系。

化疗药物增强重组可溶性TRAIL抗肿瘤作用

目的探讨化疗药物对重组可溶性TRAIL穴rsTRAIL雪抗肿瘤作用的影响及其分子机制。方法13株不同肿瘤细胞经rsTRAIL处理后,采用MTS-PMS染色法和流式细胞仪技术测定细胞凋亡率,观察肿瘤细胞对rsTRAIL的敏感性;化疗药物与rsTRAIL联合作用于敏感性不同的肿瘤细胞检测细胞敏感性的变化;免疫印迹技术分析TRAIL受体DR5蛋白表达。结果13株肿瘤细胞中约46.2%穴6/13雪的细胞株对rsTRAIL敏感;化疗药物CHX、CP和8-CA可显著提高肿瘤细胞株对rsTRAIL细胞毒作用的敏感性;8-CA和TRAIL联合作用可上调DR5的蛋白表达。结论化疗药物CHX、CP和8-CA可增强rsTRAIL的抗肿瘤作用。

自身免疫性疾病患者T细胞表面抗原CD2、CD4和CD8mRNA的表达

用斑点杂交技术检测了１８例系统性红斑狼疮（ＳＬＥ）、２２例干燥综合征（ＳＳ）、２１例类风湿性关节炎（ＲＡ）患者及１６例正常人外周血淋巴细胞ＣＤ２、ＣＤ４和ＣＤ８ｍＲＮＡ的表达水平。结果表明，这３种病人ＣＤ２ｍＲＮＡ水平均较正常人有明显升高，ＳＬＥ和ＲＡ患者ＣＤ４／ＣＤ８ｍＲＮＡ比值也明显升高，而ＳＳ患者ＣＤ４／ＣＤ８ｍＲＮＡ比值在正常范围。在Ｔ细胞发育过程中，ＣＤ２先于ＣＤ４和ＣＤ８的表达，结果提示这３种疾病患者Ｔ细胞ＣＤ２ｍＲＮＡ表达的增加．影响了ＣＤ４和ＣＤ８ｍＲＮＡ的表达，从而可以影响淋巴细胞乃至整个机体的免疫平衡。

CD3ε胞浆区Tyr突变阻断下游的细胞凋亡信号传递

目的：利用稳定表达ＣＤ８ε融合分子的细胞凋亡模型，研究其ＣＤ３εＩＴＡＭ中两个酪氨酸的突变对细胞凋亡信号传递及相关基因表达的影响。方法：将稳定表达ＣＤ８ε融合分子及其３种突变分子的Ｔ淋巴细胞分别用抗ＣＤ８单抗刺激后，检测４种细胞蛋白酪氨酸磷酸化和胞浆Ｃａ２＋浓度的变化以及细胞凋亡相关基因表达。结果：抗体刺激后，表达ＣＤ８ε的细胞与表达其３种突变分子的细胞相比，其蛋白磷酸化增加，胞浆Ｃａ２＋浓度升高；立早基因ｎｕｒ７７和细胞凋亡基因ｆａｓ表达水平升高。结论：首次发现ＣＤ３εＩＴＡＭ中两个酪氨酸的突变阻断了ＣＤ３介导的凋亡信号传导途径，并影响ｎｕｒ７７和ｆａｓ基因的表达。

抗肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体受体2嵌合抗体表达载体的构建、表达及其抗肿瘤活性分析

目的:构建抗人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)受体2(死亡受体5,DR5)的人-鼠嵌合抗体表达载体,获得稳定表达该嵌合抗体的细胞株,并分析嵌合抗体的抗肿瘤活性。方法:采用DNA重组技术,扩增抗人DR5的鼠源单克隆抗体(mAb)AD5-10的重链(HC)、轻链(LC)可变区基因片段,并将其分别插入含有人IgG重链、轻链恒定区基因的真核表达载体RpCI-neo,以重、轻链表达质粒共转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO),筛选稳定表达抗人DR5嵌合抗体(hmAD5-10)的重组细胞。采用Western blot和间接ELISA检测嵌合抗体的表达量及其与抗原DR5的结合活性。采用MTS比色法检测嵌合抗体的生物学活性。并对重组细胞株进行无血清培养驯化。结果:获得了2株稳定表达嵌合抗体的重组细胞株CHO-A5和CHO-B11,抗体的表达水平分别为(0.36±0.11)mg/L和(0.16±0.01)mg/L,嵌合抗体与DR5有较好的结合活性,对体外培养的人T淋巴细胞白血病细胞SVT35有显著的杀伤作用。结论:在真核细胞中表达了具有生物学活性的抗DR5的人-鼠嵌合抗体,为其应用于肿瘤治疗研究奠定了基础。

人外周血淋巴细胞激活与CD2 mRNA 表达

对 PHA、抗 CD3单克隆抗体 RW2—8C8、胸腺肽、抗 CD2与抗 CD3等对人 T 淋巴细胞的增殖现象及动力学进行了观察,除抗 CD3与抗 CD2单抗联合应用为抑制效应外,前三者均呈正效应且动力学完全一致.在此基础上,应用反义 CD2mRNA 探针检测了 mRNA 在激活24小时以后的变化,发现 T 细胞活化者均显示 mRNA 量呈上升;反之则不见变化或低于未激活 T 细胞对照组水平.本研究证明了小牛胸腺肽有激活 T 细胞和提高 mRNA 水平的作用,为首次报导.本文对上述在基因水平上观察的结果进行了讨论.

羟基脲增强肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体诱导的K562细胞凋亡及其分子机制

目的研究化疗药物羟基脲(HU)增强肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)诱导的K562细胞凋亡及其分子机制。方法用重组可溶性TRAIL(rsTRAIL)处理慢性髓细胞性白血病来源的K562和SVT-35细胞,采用四唑氮盐/吩嗪硫酸甲酯比色法测定细胞生长抑制率,检测细胞对rsTRAIL的敏感性;化疗药物HU与rsTRAIL联合作用于对rsTRAIL不敏感的K562细胞,用四唑氮盐/吩嗪硫酸甲酯染色法检测细胞敏感性的变化;Western blot分析凋亡相关蛋白激酶的活化水平,以及凋亡抑制蛋白细胞型Fas相关死亡区域蛋白样白介素-1β转换酶抑制蛋白(c-FLIP)和细胞凋亡抑制蛋白1(c-IAP1)的表达。结果用1μg/ml的rsTRAIL处理SVT-35细胞,其存活率达32%,而同样条件下K562细胞的存活率达93%;化疗药物HU和rsTRAIL联合处理K562细胞,与两者单独作用相比,细胞存活抑制率差异具有统计学意义;化疗药物和rsTRAIL联合处理K562细胞,Ras、丝裂原活化蛋白激酶(MEK)和细胞外调节蛋白激酶(ERK)的活化受到抑制,应激活化蛋白激酶(JNK)磷酸化水平上升;HU和rsTRAIL联合处理抑制凋亡抑制蛋白c-FLIP和c-IAP1的表达。结论 HU促进rsTRAIL诱导的K562细胞凋亡可能通过抑制Ras-MEK-ERK信号通路,激活JNK激酶,抑制c-FLIP和c-IAP1的表达。

死亡受体5氨基末端的结构与功能

目的研究死亡受体5(DR5)氨基末端的结构与功能。方法利用基因工程技术构建一系列DR5胞外区(DR5-ECD)缺失突变体并获得相应的重组蛋白。利用蛋白免疫印迹及ELISA技术研究重组蛋白与小鼠抗人DR5单克隆抗体AD5-10的结合情况。结果含有完整氨基末端结构的DR5-ECD缺失突变体能够与AD5-10结合,而缺失氨基末端的重组蛋白则不能与AD5-10相互作用。结论 DR5氨基末端含有AD5-10激动性抗体的靶点,该靶点可能在发展肿瘤免疫治疗新策略中发挥重要作用。