DNA汇集法高效筛查Vel阴性稀有血型的研究

目的通过汇集标本的方法,建立高效筛查稀有血型的试验体系。方法根据Vel阴性(Vel-)稀有血型产生的分子机制,分别设计可特异扩增Vel血型基因SMIM1野生型序列和缺失突变序列的2组引物;合成Vel-对照质粒。将对照质粒与不同数量的随机标本进行汇集,根据扩增结果确定合适的汇集标本数;用缺失突变序列的特异性引物扩增汇集标本,如出现特异性目的条带,则用2组引物进行拆分检测参与汇集的标本,确认基因型。限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)和DNA测序用于验证筛查结果。结果结合单个随机标本的浓度,最终确定4个血样汇集的筛查体系,可将试验所用时间及检测费用降低4倍。我们在9 122例标本中筛查到1例Vel血型基因SMIM1 c.64_80杂合缺失突变的个体。结论汇集方法的使用大大降低了筛查工作的时间和费用,可推广应用于具有类似分子机制的稀有血型的大规模筛查。

ABO基因第7外显子c.721C>T变异导致ABO亚型的研究

目的:分析ABO基因第7外显子c.721C>T变异导致的不同亚型,探讨影响抗原表达的分子机制。方法:通过标准血型血清学方法鉴定7例样本的ABO亚型,应用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)法扩增ABO基因第6、7外显子及相关内含子,并进行直接DNA测序和克隆测序。结果:7例ABO表型分别为:A_(w) 1例、B_(w) 3例、AB_(w) 2例、A2或A_(int) 1例。测序发现,ABO基因第7外显子分别在A1.02、B1.01和O.01.02等位基础上发生了c.721C>T变异,等位基因分别为AW.43(1例)、BW.03(5例)和O.01.07(1例),基因型分别为ABO*AW.43/O.01.02(1例)、ABO*BW.03/O.01.01(3例)、ABO*A1.02/BW.03(2例)和ABO*A2.05/O.01.07(1例)。结论:ABO基因c.721C>T变异引起241位氨基酸精氨酸(Arg)被色氨酸(Trp)替换,导致α-1,3-N-乙酰半乳糖胺基转移酶(GTA)或α-1,3-D-半乳糖基转移酶(GTB)活性降低,抗原表达减弱。在O.01.02基础上产生c.721 C>T变异形成的O.01.07等位基因,是一个无效等位基因,不能形成有催化功能的酶,对A2亚型抗原的表达无影响。

已知HLA单采血小板供者资料库库容估计

目的:探讨江苏地区汉族人群HLA-I类抗原已知的单采血小板供者库的合适的库容水平。方法:采用Luminex-SSO法对16 062名江苏部分地区造血干细胞捐献者进行HLA基因分型。根据HLA-Ⅰ类(A, B位点)表型频率计算找到HLA匹配供者概率。结果:获取了江苏部分地区HLA-Ⅰ类(A, B位点)表型群体遗传学资料,利用表型群体遗传学资料估计推测出了已知HLA单采血小板供者资料库库容。结论:建立一个总库容1 500人的血小板捐献者资料库是恰当的,它可以满足表型频率> 0.002的患者有95%的可能性找到至少1名表型相同的供者。

RhD阴性孕妇产前意外抗体筛查回顾性分析

目的:回顾性分析RhD阴性孕妇产前意外抗体筛查情况。方法:对2013—2017年江苏省血液中心RhD阴性孕妇血液标本进行RhD确认试验;同步采用盐水介质法及抗人球蛋白法对血清中意外抗体进行筛查;并分析抗体特异性,同时测定效价。结果:430位孕妇中,RhD确认试验21位为阳性,409位为阴性。总计435次筛查中(含5例再次妊娠者),意外抗体筛查阳性共28例(6.44%,28/435),其中18例抗D(效价2~256),1例抗C(效价8),2例抗CD(效价2),1例抗M(效价8),2例抗Lea(效价2),另有4例含低效价IgM型冷抗体,特异性不明。每位孕妇意外抗体检测频次不一,初次检测时机以及间隔期不尽相同。只检测1次的共269例,检测2~6次的分别为108、40、8、8及1例,最高1例检测频次为10次;每频次IgG型意外抗体检出率(%)分别为:3.72(10/269)、3.70(4/108)、5.00(2/40)、0.00(0/8)、50.00(4/8)、0.00(0/1)、100.00(1/1);检测频次与抗体阳性率并不完全呈正相关。结论:RhD阴性孕妇存在一定比例的意外抗体,规范产前抗体筛查流程有助于保障孕妇输血安全及早期干预新生儿溶血病。

采用二硫苏糖醇消除抗CD38单抗干扰血型血清学检测1例

目的探讨采用二硫苏糖醇(Dithiothreitol,DTT)消除抗CD38单抗对于多发性骨髓瘤患者血型血清学检测干扰的方法。方法对1例采用抗CD38单抗治疗的多发性骨髓瘤患者常规进行血型血清学检测,包括直接抗球蛋白试验和不规则抗体筛选等;进一步采用放散技术、酶技术及DTT处理红细胞后进行不规则抗体鉴定。结果该患者直接抗球蛋白试验阴性,不规则抗体筛选呈现出泛反应特征;使用DTT处理细胞后,可消除泛反应化。结论抗CD38单抗的治疗会造成血型血清学检测干扰现象,DTT可有效地消除干扰,从而有效保障患者输血安全。

基于MassARRAY平台的人血小板抗原基因分型的质谱检测方法

目的:建立基于MassARRAY质谱iPLEX分析技术的人血小板抗原(human platelet antigen,HPA)基因分型方法。方法:通过文献检索HPA1-29W系统的单核苷酸多态性突变或缺失位点的信息,确定35个目的基因突变位点,按MassARRAY突变位点标示方法、引物设计固定格式和引物设计软件在线设计90条引物(正、反向扩增引物和延伸引物各30条),以12个插入HPA1-29W野生型和突变型序列的合成质粒以及50例已知HPA分型的献血者样本进行扩增和质谱检测,分析灵敏度、特异度和重复性,随机抽取15例样本的一代测序和质谱分型结果进行对比验证,建立检测方法。结果:基于MassARRAY平台的HPA基因分型的质谱检测方法与测序法检测结果相符合,灵敏度为100%,特异度为100%,重复性为100%。结论:成功建立基于MassARRAY平台的HPA1-29W系统的质谱分型方法,适合中国人群HPA分型,具有临床应用前景。

南京地区血小板捐献者HPA-1-29bw基因分型检测

目的了解南京地区汉族血小板捐献人群血小板抗原1~29(HPA-1-29bw)等位基因频率,为患者相容性血小板输注提供依据。方法采用一代测序法(Sanger测序法)对2019年2月~2019年9月在本中心捐献血小板的900名南京汉族固定捐献者做HPA基因分型,并采用直接计数法计算等位基因频率和基因型频率等。结果本组900名汉族单采血小板捐献者HPA等位基因频率分别为:HPA-1a 0.995 0、1b 0.005 0,2a 0.9467、2b 0.053 3,3a 0.585 0、3b 0.415 0,4a 0.998 9、4b 0.001 1,5a 0.982 2、5b 0.017 8,6a 0.982 8、6b 0.017 2,11a 0.999 4、11b 0.000 6,15a 0.531 7、15b 0.468 3,21a 0.992 8、21b 0.007 2;HPA-7-10w、-12-14w、-16-20w和-22-29bw均只检出单一a等位基因;本组中HPA-15不配合率最高[37.40%(337/900)],其次为HPA-3[36.77%(331/900)],另外在HPA-11w中检出1例杂合子。结论南京地区汉族血小板捐献人群HPA等位基因频率特点是HPA-15和HPA-3为最常见的杂合子,在本地临床输注中须引起重视。

c.955C>G变异致ABO等位基因增强现象的研究及文献复习

目的鉴定ABO疑难血型基因型,分析ABO亚型中等位基因增强现象的遗传规律。方法采用血清学方法检测ABO血型,PCR扩增测序ABO基因编码区、上游CBF/NF-Y增强子区、启动子和内含子1中红细胞特异性调节元件的核苷酸序列,克隆测序ABO基因第6和7外显子分析鉴定其基因型。结果血清学结果提示患者为A_(亚)B型,基因测序结果发现其为A/B杂合子。克隆测序确定一个等位基因为ABO*A1.02+c.955C>G,另一个等位基因为ABO*B.01。结论A基因携带c.955C>G(p.Leu319Val)变异且与B基因同时遗传时,存在等位基因增强现象。

AW.37/B.01亚型孕妇家系调查及新生儿血型鉴定探讨

目的通过鉴定1例患者及其家系成员的ABO疑难血型并制定合理的输血策略,探讨新生儿ABO血型正定型检测的准确性。方法血型血清学方法鉴定ABO血型表型,利用分子生物学方法进行ABO基因分型检测,通过测序确定家系成员ABO血型基因型。结果先证者血清学ABO血型正反定型不一致,血清学检测格局为A_亚B,ABO基因测序发现ABO~*A1.01等位基因第7外显子940位碱基发生A>G变异,导致314位赖氨酸被谷氨酸替换,该患者ABO血型的基因型为ABO~*AW.37/B.01;其父血清型格局为A_亚,基因型为ABO~*AW.37/O.01.02。结论AW.37等位基因可在人群中稳定遗传,并可能影响新生儿血型鉴定。

采用熔解曲线法进行RHD c.1227G>A基因检测研究

目的:建立用于RHD c.1227G>A基因检测的熔解曲线分析方法。方法:根据RHD c.1227G>A基因位点设计并合成序列特异性引物,在荧光定量PCR反应后对产物进行熔解曲线分析,根据熔解曲线峰值的差异进行基因检测结果判断,并与常规序列特异性引物PCR(PCR-sequence specific primer,PCR-SSP)RHD c.1227G>A基因分型方法进行比较;对与血清学结果不一致的标本进行测序分析。结果:在87例血清学初筛为RhD阴性表型的标本中,采用熔解曲线分析法,检测出16例含有RHD c.1227G>A,占比18.4%;与常规PCR-SSP分型结果一致。对1例与血清学吸收放散结果不一致的标本进行RHD exon 9测序分析,证实均为1227A纯合子。熔解曲线分析法的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和总符合率均为100%,约登指数为1.0。结论:成功建立用于红细胞RHD c.1227G>A基因分型的熔解曲线分析方法,可以高效、快速地进行RHD c.1227G>A基因检测研究。

芹菜素增强阿司匹林对结肠癌细胞的增殖抑制作用及其机制研究

目的:研究芹菜素(apigenin)能否增强阿司匹林(aspirin)对结肠癌细胞系的增殖抑制作用,并阐述其机制。方法:选取HT-29、HCA-7、Moser和DLD-1细胞系,设置空白对照组、芹菜素(10μmol/L)组、阿司匹林(2.5、5、10 mmol/L)组、联合用药组。MTT法检测细胞存活率。免疫印迹法和逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)检测不同处理方式对Moser细胞环氧合酶-2(cy clooxygenase-2,COX-2)表达的影响。免疫印迹法检测不同处理方式对由TNF-α诱导的IκBα降解的抑制,以此来反映不同处理方式对NF-κB活性的影响。结果:芹菜素呈剂量和时间依赖性地增强阿司匹林对表达COX-2的结肠癌细胞增殖的抑制,并协同增强阿司匹林对COX-2表达的抑制和对TNF-α诱导的IκBα降解的抑制。结论:芹菜素能通过抑制COX-2的表达而增强阿司匹林对结肠癌细胞的增殖抑制。

抗体特异性预测方法克服HLA-Ⅰ类抗体所致血小板输注无效患者1例

血小板输注主要用于预防和治疗血小板减少或血小板功能缺陷引起的出血,血小板输注无效是指输注后血小板计数增量低于预期,是血小板输注的一种主要并发症。血小板输注无效可能导致出血风险增加,死亡率增加,住院时间延长导致医疗费用增加。

一例产生抗-D的弱D100型个体的基因突变分析

目的:对临床送检的一例产生抗-D的RhD变异型个体进行RHD基因分析,预测与分析突变对RhD蛋白的影响,评估该变异D类型的临床意义。方法:采用聚合酶链反应(PCR)直接测序法对RHD基因10个外显子及侧翼序列进行序列分析。采用PCR-序列特异性引物对患者RHD基因进行合子型分析。使用PyMOL软件分析突变引起的RhD蛋白三维结构的变化。利用蛋白质变异效应分析、分类非容忍变异和多态性表型分型算法三种在线软件预测突变导致的氨基酸替换对RhD蛋白功能的影响。结果:该变异D个体为RHD(+)/RHD(-)杂合子型。测序结果显示在第5外显子有c.787G>A突变,该突变导致263位甘氨酸被精氨酸替代。PyMOL分析结果显示,与野生型相比,精氨酸与相邻氨基酸之间的氢键变短、氢键数增加。3种蛋白功能损伤预测软件中,有2种提示p.G263R对RhD蛋白是"有害突变"。结论:该D变异型为弱D100型。c.787G>A突变导致的氨基酸替换可能影响RhD蛋白的正确组装折叠,导致RhD抗原特征的改变。这提示该D变异型被正常D抗原免疫后具有产生抗-D的潜力。

如何实现高速公路联网收费的拆分

在高速公路实行联网收费的情况下,通行费拆分的及时性和准确性,是各高速公路管理单位十分关心的问题,本文介绍了山东省高速公路联网收费拆分的基本情况和做法。

人工养熊无异物植入活体取胆汁的手术方法

作者在 1 991～ 1 998年期间 ,进行了人工饲养黑熊无异物植入活体引流胆汁手术方法的研究。摸索进行了胆囊壁瓣管道成型术、胆囊腹壁造瘘术及其改良Ⅰ式和改良Ⅱ式的手术方式 ,解决了人工饲养黑熊无异物植入活体引流胆汁难处理的非引流胆汁外渗、切口及瘘道易封闭等问题。手术操作及引流取胆汁操作简单 ,胆囊不易感染 ,引流胆汁量多质好 ,便于生产管理。同时引流取胆汁的熊在繁殖期仍可参加繁殖 ,形成了引流胆汁。

变异型D产生抗-D合并抗-C及抗-Jkb抗体1例

报道1例患有溶血性贫血、系统性红斑狼疮的患者,因配型困难由临床送检血样至实验室检测。患者初筛血型为O型RhD阴性,使用3种不同的单克隆抗-D试剂,分别在盐水介质和抗人球介质对患者RhD表型进行确认。在盐水介质中,患者血样与所有IgM型抗-D不凝集,在抗人球介质中与所有IgM+IgG型抗-D试剂均凝集,为RhD变异型。使用谱细胞对患者血清进行抗体鉴定,发现患者血清中含有抗-D、抗-C和抗-Jkb抗体。患者小因子表型为ccEe, Kidd系统抗原表型为Jk(a+b-)。选择与患者抗原匹配的供者红细胞4 U分2次予以输注,患者血红蛋白有效提升。Rh系统的抗原免疫原性高,Rh系统的抗体可引起严重的新生儿溶血病和溶血性输血反应,因此Rh系统表型和抗体的准确鉴定对于输血安全具有重要的临床意义。对于需要反复输血的患者,若能提供Rh抗原匹配的供者红细胞可大大降低患者被同种免疫的概率。

洱海骨顶鸡(Fulica atra)的日间越冬行为研究

2016年冬季在中国云南大理洱海湖滨带采用瞬时扫描法观察骨顶鸡(Fulica atra)越冬行为的昼间时间分配和活动节律。177次扫描结果表明,在时间分配上,取食是骨顶鸡在洱海越冬最主要的行为,占(63±19)%;其次是休息,占(14±17)%;游泳占(11±11)%,理羽占(9±9)%,警戒和其他行为占比很小。在取食行为上,洱海中的骨顶鸡以表面进食为主,占取食行为总时间的(79±11)%。在日间行为节律上,本研究中骨顶鸡具有一天两次的休息高峰期,即中午和黄昏时分。

新疆伊犁地区Vel-稀有血型的基因筛查及SMIM1基因分析

目的在新疆伊犁地区献血人群中筛查Vel-稀有血型,评估Vel血型SMIM1 c.64_80del等位基因的频率,了解新疆伊犁地区Vel-稀有血型的分布情况。方法采用DNA汇集法PCR-序列特异性引物(polymerase chain reaction-sequence specific primers,PCR-SSP)筛查新疆伊犁地区Vel血型基因SMIM1 c.64_80缺失变异个体;对筛查到含缺失变异个体的SMIM1基因第3外显子进行测序以验证PCR-SSP结果;对SMIM1基因第2内含子直接测序分析与Vel表达量相关的单核苷酸位点多态性。结果在新疆伊犁地区3328名献血者中,发现14人为SMIM1 c.64_80杂合缺失个体,SMIM1 c.64_80del等位基因频率为0.21%,未见纯合缺失个体。14名SMIM1 c.64_80杂合缺失个体rs1175550位点的基因型均为AA,其中5人SMIM1第2内含子存在7111 ins GCA(rs143702418)杂合变异。结论新疆伊犁地区SMIM1 c.64_80del等位基因的频率尚未见报道,本文研究结果丰富了中国不同地区人群Vel血型等位基因数据。

一例Vel血型基因杂合缺失个体的家系调查及基因分析

目的鉴定1例Vel血型基因SMIM1的个体突变情况，并对其家系进行调查和基因分析，以期找到罕见的纯合缺失即Vel阴性（Vel-）的突变个体。方法根据Vel-产生的分子机制分别设计可特异扩增野生型和缺失突变SMIM1序列的引物，采用序列特异性引物PCR检测样本的基因型，通过DNA测序分析确证基因型，并开展家系调查和基因分析。结果PCRSSP和DNA测序结果显示，先证者Vel血型基因SMIM1C．64-80连续17个核苷酸发生了杂合缺失突变。家系分析显示先证者的父亲与其基因型相同，为杂合缺失突变，母亲和姐姐SMIM1无缺失突变。在其家庭成员中未发现纯合缺失突变个体。结论结合PCR—SSP和DNA测序分析，鉴定了1例SMIM1 c．64-80杂合缺失的个体。先证者的杂合缺失突变遗传自其父亲。

Bw11亚型家系表现ABO等位基因竞争现象的研究

目的分析携带ABO*BW.11等位基因的家系成员ABO血清学和分子生物学特征。方法应用血清学方法检测先证者及其家系成员共9人的ABO血型表型。采用PCR方法扩增ABO基因第6、7外显子并对扩增产物直接测序,同时克隆测序先证者及其父亲的标本。结果血清学检测初步判断先证者及其弟弟为AB亚型,先证者的父亲及其两女儿为B亚型。克隆测序发现先证者ABO等位基因第7外显子在B101的基础上第695位碱基发生T>C变异,表明为ABO*BW.11等位基因。先证者的父亲、弟弟及其两个女儿均携带该变异等位基因。A基因与BW.11以及BW.11与O基因同时遗传时竞争现象存在明显差异。结论ABO基因c.695T>C变异可能会导致Bw11亚型存在等位基因竞争现象。分子生物学方法结合血清学方法有助于精准鉴定ABO疑难血型。