心肌致密化不全患者特异性诱导多潜能干细胞及心肌样细胞的构建

目的构建心肌致密化不全(noncompaction of ventricular myocardium,NVM)患者来源的诱导多潜能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPS)及心肌样细胞(cardiomyocytes,CMs)。方法用仙台病毒感染1名NVM患者(女性,16岁,2016年我科住院患者)和1名同期24岁健康男性志愿者的尿液细胞获得iPS细胞,进而将iPS细胞诱导分化为iPS-CMs。对iPS和iPS-CMs进行免疫荧光染色检测干细胞和心肌细胞标志物、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AP)活性检测、核型分析、拟胚体(embryoidbodies,EBs)形成和膜片钳试验检测,同时采用全外显子测序(whole exon sequencing,WES)对NVM患者血液、iPS及iPS-CMs进行遗传学背景的比较,并筛选出可能和NVM发生相关的突变基因。结果成功获得NVM患者及正常人的尿液细胞和iPS,并分化为iPS-CMs。免疫荧光显示iPS表达干细胞标志Oct4、Sox2、Ssea4和TRA-1-81,iPS细胞具有高AP活性、具有正常核型、克隆能够在体外悬浮培养分化成3个胚层的细胞;iPS-CMs表达心肌细胞特异性标志物α-actinin和TNNT2,膜片钳结果显示iPS-CMs形成心肌细胞特异性钠电流及动作电位。WES结果显示患者血液、iPS及iPS-CMs三者具有相似的遗传谱,并发现可能与NVM发生相关的突变。结论成功构建出NVM患者的iPS-CMs,为采用iPS技术开展NVM的研究提供有力的细胞模型。

心肌致密化不全新致病基因的筛选及其表达特征变化

目的筛选心肌致密化不全(left ventricular noncompaction,LVNC)的致病基因并进行功能验证,为研究发病机制、遗传咨询和早期干预提供依据。方法收集自2018年1月至2020年12月于重庆医科大学附属儿童医院门诊就诊的3个LVNC家系的血液样本进行全外显子测序(whole-exome sequencing,WES),得到3个家系均筛选出的可能致病基因,同时分别构建LVNC患者和正常人来源的诱导多能干细胞-心肌细胞(induced pluripotent stem cells-cardiomyocytes,iPSC-CMs)模型,收取不同时间点的细胞,采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)对上述基因进行验证,观察它们在诱导分化过程中的表达特征变化。结果WES筛选出3个LVNC家系共同的可能致病基因14个,qPCR检测结果提示这些基因在不同的时间点(0、10、20、30 d)表达量发生动态改变,并且在正常组及LVNC患者组间其表达量存在明显差异。结论3个LVNC家系通过WES筛选出的14个共同的可能致病基因,涉及影响细胞骨架、细胞极性、钙离子钾离子调节及能量代谢等方面。

细胞骨架及极性在心肌致密化不全患者来源心肌样细胞中的改变

目的探讨心肌致密化不全(left ventricular noncompaction,LVNC)患者来源的心肌样细胞(cardiomyocytes,CMs)骨架与极性的改变及机制。方法以LVNC患者及正常人来源的多潜能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)诱导分化的心肌样细胞为模型,进行转录组测序,透射电镜观察两组细胞骨架改变,免疫荧光观察细胞骨架相关蛋白纤维状肌动蛋白(F-actin)、微管蛋白二聚体(ɑ/β-tublin)、极性蛋白par6和黏着斑蛋白(vinculin)在两组心肌细胞中的表达和分布,Western blot检测细胞骨架及极性Rho/Rock通路关键蛋白Ras同源基因家族成员A(ras homolog gene family member A,RhoA)的表达。结果两组细胞均阳性表达胚胎干细胞表面分子标志物Oct4、Sox2、SSEA4、TRA1-81,且可诱导产生具有自主搏动节律的心肌细胞团,免疫荧光检测示心肌细胞表面标志cTnT、ɑ-actinin表达阳性,转录组测序结果显示有多个差异基因与微管联系紧密;与正常组相比,透射电镜观察到疾病组心肌细胞骨架排列紊乱,免疫荧光发现骨架相关蛋白ɑ/β-tublin表达下调[n=62,(226.4±65.1),Z=-3.451,P<0.01],F-actin表达下调[n=62,(236.4±33.2),P<0.001],vinculin表达下调且分布不均匀,于细胞膜处明显浓聚[n=57,(137.2±35.9),Z=-3.852,P<0.001],极性蛋白par6表达上调[n=64,(-132.7±43.5),Z=-3.148,P<0.01];Western blot结果提示患者组RhoA蛋白表达水平明显上调(P<0.01)。结论LVNC患者来源的心肌细胞骨架和极性存在异常。