利用傅立叶红外光谱和原子力显微镜研究超声提取对鸡腿菇多糖结构的影响

利用沸水浴法和超声辅助提取法提取鸡腿菇粗多糖,分别得到对应的多糖水浴提取的多糖(WCP)和超声提取的多糖(UCP)。采用苯酚硫酸法测得WCP和UCP中的总糖质量分数分别为87.997%和72.937%。用季铵盐沉淀法和Sephadex G 200凝胶层析法对WCP和UCP进行分离纯化,得WCP3 1、UCP3 1 2个主要组分,用傅立叶红外光谱(FTIR)和原子力显微镜(AFM)对提取多糖的结构进行表征。结果显示:WCP3 1和UCP3 1均具有一般多糖类物质的特征吸收峰,WCP3 1和UCP3 1的单糖残基均以β吡喃环存在,但超声波可导致部分C O双键断裂形成C—O链接;WCP3 1呈现大量的近似螺旋聚集体和少量球状聚集体,但是UCP3 1是较小的分散球状聚集体,说明超声波可断裂多糖的分子链间或链内氢键,导致近似螺旋聚集体的降解。

鸡腿菇多糖WCP3a的抗氧化活性与空间结构的关系

研究鸡腿菇多糖WCP3a的体外抗氧化活性与空间结构的关系。邻苯三酚自氧化法检测结果表明,在实验质量浓度范围内,鸡腿菇多糖WCP3a对超氧阴离子自由基(O-2.)有一定的清除作用,并且当多糖质量浓度为0.6mg/mL时对O-2.的清除效果最明显;刚果红实验和原子力显微镜技术检测结果表明,鸡腿菇多糖WCP3a为单股螺旋结构;用不同浓度NaOH溶液处理WCP3a,产生不同空间构象的多糖样品WCP3a-0.2和WCP3a-0.4,检测两者清除O-2.的能力,与WCP3a对比发现,WCP3a-0.2和WCP3a-0.4对O-2.的清除效果均优于WCP3a,且WCP3a-0.4的清除能力最强;原子力显微镜观测结果发现,NaOH碱性环境使缠绕成股的多糖分子逐渐解聚,且不同浓度NaOH溶液对多糖裂解程度不同。鸡腿菇多糖WCP3a的体外抗氧化活性与其空间结构关系更密切。

超声波萃取技术在农业科学中的应用研究进展

超声波萃取技术已广泛用于食品、药物、工业原材料等样品中有机或无机组分的分离和提取,分析超声波萃取技术在农业科学研究领域中的应用,以促进超声波萃取在分离提取技术领域的发挥。

蚊耐氯菊酯C6/36细胞构建及耐药相关基因PR-XP1的表达分析

建立蚊耐氯菊酯C6/36细胞,并探讨PR-XP1基因与蚊C6/36细胞对氯菊酯的耐药性之间关系。采用逐步诱导法筛选蚊耐氯菊酯C6/36细胞,观察耐药细胞形态变化、生长状态,测定生长曲线和半数致死剂量;利用荧光实时定量PCR鉴定PR-XP1基因在敏感细胞与耐药细胞中的表达差异。获得耐400μg/m L氯菊酯的C6/36细胞;实时定量PCR检测发现抗药基因PR-XP1在蚊耐氯菊酯C6/36细胞中表达量明显上升。表明构建蚊耐氯菊酯C6/36细胞是研究蚊虫氯菊酯耐药性的有效方法,初步证明PR-XP1基因表达升高可能与蚊虫对氯菊酯的耐药性具有一定的相关性。

鸡腿菇多糖硫酸酯化条件的优化及抗氧化活性研究

【目的】研究硫酸酯化修饰对鸡腿菇多糖(WPC)抗氧化活性的影响,为天然抗氧化剂的开发利用提供理论依据。【方法】采用氯磺酸-吡啶法,制备硫酸酯化多糖(SWPC);以取代度为指标,采用单因素试验对制备SW-PC的酯化条件进行优化;采用邻苯三酚自氧化法和邻二氮菲-金属铁离子-H2O2体系,研究SWPC的体外抗氧化活性。【结果】最佳酯化条件为:酯化试剂体积比(V(氯磺酸):V(吡啶))1:3,反应温度90℃,反应时间2h。SWPC对羟自由基和超氧阴离子自由基均具有清除能力;与WPC相比,SWPC清除羟自由基的能力显著提高,但清除超氧阴离子自由基的能力有所下降。【结论】SWPC对羟自由基和超氧阴离子自由基均具有一定的清除能力,但对不同基团的敏感性差异明显。

柴胡多糖的结构和抗氧化活性分析

用超声波辅助提取法从柴胡中提取、分离得到多糖SAP3。高效液相色谱法测定其相对分子质量，红外光谱、气相色谱和原子力显微镜对其结构进行初步分析。结果表明：柴胡多糖SAP3是组分均一的多糖，由鼠李糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖组成，平均相对分子质量为3．3×10^5。红外光谱分析表明：柴胡多糖具有一般多糖类物质的特征吸收峰，单糖残基以吡喃环的形式存在。原子力显微镜显示柴胡多糖糖链具有分支结构，并缠绕形成环状结构。在0．2—1．2ms／mL的实验浓度范围内，随着多糖质量浓度的升高，柴胡多糖SAP3对·OH的清除率逐渐增大，最大清除率可达45．2％。

女贞子多糖结构的原子力显微镜研究

水提女贞子粗多糖经过纯化得到三种多糖分别为LL-Ⅰ1,LL-Ⅰ2,LL-Ⅲ。用气相色谱对女贞子多糖组分进行分析,用原子力显微镜对其结构形态进行观测,结果表明,LL-Ⅰ1,含有鼠李糖/核糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖;LL-Ⅰ2,含有鼠李糖/核糖和葡萄糖;LL-Ⅲ含有鼠李糖/核糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖。原子力显微镜分析表明LL-Ⅰ1,LL-Ⅰ2,LL-Ⅲ分别不同程度的聚集成股,且具有螺旋结构。这种现象可能与聚集体的分子间相互作用和糖链间的氢键缔合有关。

MTT法评价3种鸡腿菇多糖的体外抗肿瘤活性

采用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测超声辅助提取后经季铵盐沉淀分级得到的鸡腿菇多糖(UCP-3)、硫酸酯化鸡腿菇多糖(SWCP)和羧甲基化鸡腿菇多糖(CWCP)对人白血病K562细胞体外生长的抑制活性,研究不同的处理工艺对鸡腿菇多糖体外抑制K562细胞增殖活性的影响.结果表明:3种鸡腿菇多糖均可抑制K562细胞的体外生长,抑制作用随着多糖浓度和作用时间的变化而变化;超声处理多糖可能引起单糖之间连接方式变化进而使得其生物活性发生改变;SWCP与CWCP对K562细胞的体外生长抑制作用明显,所以对鸡腿菇多糖进行化学修饰有助于提高其生物活性.

嗜热菌PIF1解旋酶的生化活性研究

小整合频率1(petite integration frequency 1,PIF1)解旋酶广泛存在于生物体内,在核酸的代谢过程中发挥着重要作用。近年来,人们已经报道了多种PIF1解旋酶的生化活性及三维结构,但对极端环境下细菌的PIF1解旋酶的报道仍较少。本文利用多种生物化学与生物物理学技术,对黄石热脱硫弧菌PIF1(Ty.PIF1)解旋酶进行了多方面研究。通过原核表达纯化系统,获得了纯度90%以上,均一性好的Ty.PIF1蛋白。Ty.PIF1在溶液中为单体,分子量约为60 kD。Ty.PIF1具有很高的热稳定性,在65℃以下时,二级结构保持稳定,大于70℃时,二级结构才会发生改变。Ty.PIF1在体外最适解旋温度为45℃,并非黄石热脱硫弧菌生存的最适温度,预示着Ty.PIF1在体内发挥活性时,可能需要其他辅助因子的参与。Ty.PIF1的酶活力温度范围较宽,在20~55℃均具有解旋活性,在55℃能解旋预示了Ty.PIF1具有耐热特性。Ty.PIF1偏向于同含有单链的底物结合,但对单链长度有一定要求,其长度至少大于4 nt;Ty.PIF1也会较好地结合无单链尾链的G4结构,说明Ty.PIF1可能有专门结合G4结构的区域。Ty.PIF1能解开一系列带有5′-单链尾链的类似于复制中间体的底物,且对底物结构有一定的偏好性;Ty.PIF1也可以解开含有G4结构的底物,DNA-RNA杂交链、RNA-loop结构,预示着Ty.PIF1在生物体内有着多种生物学功能。Ty.PIF1解旋带有不同长度5′-单链尾链的双链底物时,尾链长度越长,解旋速率越快,预示着Ty.PIF1可能与Sc.PIF1一样有着较低的解旋持续性。本文将Ty.PIF1的生化活性与其它物种的PIF1解旋酶进行了比较,找出了其中的共性与差异,加深了人们对嗜热菌PIF1解旋酶的认识,为今后研究其它极端环境微生物的PIF1解旋酶提供了一些思路。

超声提取对鸡腿菇多糖AP1结构的影响

对传统热水浸提取和超声辅助提取得到的鸡腿菇多糖AP1和CAP1的结构进行分析比较,研究了超声辅助提取对鸡腿菇多糖AP1结构的影响.结果表明：AP1由甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成,CAP1由木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成.红外光谱表明多糖AP1和CAP1在4 000~650 cm-1具有多糖类物质的特征吸收峰;不同的是,AP1的红外光谱中在865、764 cm-1处有吸收峰,而CAP1在903、8267、56 cm-1处有吸收峰.原子力显微图中均显示多糖线形并具有分支结构.超声对其影响可能是引起了单糖之间连接的方式变化,进而更易散开形成较均匀的网状.

嗜热脱铁去硫弧菌Pif1解旋酶生物学活性的分子特征分析

已知Pif1解旋酶在维持基因组稳定性方面发挥重要作用,且不同生物Pif1解旋酶具有不同的生物学活性;然而迄今为止,嗜热细菌Pif1解旋酶的生物学活性分子特征的研究尚未见报道。本文运用生物化学与生物物理学前沿技术,系统地研究了嗜热脱铁去硫弧菌Pif1解旋酶(Defe.Pif1)结合活性与解旋活性的分子特征。通过原核表达纯化系统,本研究获得纯度95%以上、无标签的Defe.Pif1蛋白。利用荧光偏振技术研究Defe.Pif1结合反应的底物特异性,揭示出Defe.Pif1优先结合ss DNA与G4 DNA,并对含3'-尾链的部分双链底物有较强亲和力,其结合反应底物特异性为:ss DNA>G4 DNA>3'-ss DNA-ds DNA≈Y-structure>Other substrates。通过快速停留检测技术研究Defe.Pif1的解旋活性,明确其最适解旋温度为50℃,最佳反应溶液为10 mmol/L Na Cl、3mmol/L DTT、3 mmol/L Mg Cl2及1 mmol/L ATP;进一步的解旋动力学特征分析结果显示,Defe.Pif1可以高效解旋含G4结构的DNA底物,其解旋5'-G4-ds DNA底物时的解旋幅度超过90%,解旋速率也与其解旋5'-ss-ds DNA底物的速率相近,提示Defe.Pif1解旋G4 DNA更接近Bs.Pif1的单体反应模式。此外,本研究还发现Defe.Pif1解旋不同类型复制叉/复制泡底物时拥有独特的解旋倾向性:与解旋其它复制中间体DNA的低效性不同,Defe.Pif1解旋12nt-bubble底物的速率与幅度均较高,暗示12nt-bubble结构很可能是该解旋酶复制中间体的天然底物。上述结果证明,Defe.Pif1不仅具有Pif1解旋酶家族成员共同的结合与解旋G4 DNA等活性特征;而且作为嗜热细菌的解旋酶,它还具有独特的反应条件与解旋底物特异性。本研究为研究Pif1解旋酶家族其它成员的分子特征与生物功能提供了潜在的研究策略,为阐明此类Pif1解旋酶的分子作用机制奠定实验基础。

厌氧棒菌Pif1解旋酶的表达纯化及解旋条件优化

【目的】通过原核表达系统获得嗜热的厌氧棒菌(Anaerobaculum hydrogeniformans)DNA解旋酶Pif1(AnaPif1),研究其体外最佳解旋条件,为深入研究嗜热菌Pif1家族解旋酶工作机理提供参考。【方法】构建重组载体pET15b-sumo-AnaPif1,将重组载体转入表达菌株BL21(DE3)中诱导表达目的蛋白,经Ni-NTA柱和Heparin柱纯化最终获得全长AnaPif1蛋白;利用停流-荧光共振能量转移(FRET)技术,以pH值和Tris-HCl、NaCl、MgCl_2浓度及反应温度、能量供体为考察因素,以反应时间常数或速率常数为指标,摸索该蛋白在体外的最佳解旋条件、最佳能量供体以及底物的偏好性。【结果】成功构建了pET15b-sumo-AnaPif1重组表达载体,通过诱导表达,获得了纯度大于95%的全长AnaPif1蛋白,其大小为55ku,等电点为6.89。AnaPif1在体外的最佳解旋条件为:Tris-HCl(pH7.0)20mmol/L、NaCl 20mmol/L、MgCl_22mmol/L、反应温度37℃;其能够利用4种核苷三磷酸(ATP/GTP/CTP/UTP)作为能量供体,但对ATP有偏好性;该酶还能解旋多种底物(双链DNA、G4-DNA),且对底物选择无明显偏好性。【结论】获得了纯化的AnaPif1解旋酶,明晰了其最佳解旋条件、能量供体及底物的偏好性特征。

一种嗜热菌Pif1解旋酶的表达纯化及活性分析

【目的】利用大肠杆菌表达纯化嗜热脱铁去硫弧菌(Deferribacter desulfuricans)解旋酶DePif1,并对其结合与解旋DNA的活性进行分析,为Pif1家族解旋酶结构和功能的阐明奠定基础。【方法】将促溶标签SUMO编码序列和人工合成的DePif1解旋酶编码序列依次连入pET15b载体,获得重组融合表达载体pET15b-SUMO-DePif1,然后将其导入E.coli BL21(DE3)菌株进行诱导表达;利用Ni-NTA亲和层析柱获得融合蛋白,SUMO蛋白酶酶切去除融合标签,再经Heparin和Ni-NTA柱分离获得无标签的纯化重组DePif1蛋白;采用荧光各向异性分析,研究pH和NaCl浓度对DePif1与DNA结合的影响及DePif1与不同底物(单链DNA、双链DNA和G4-DNA)的结合特性;使用基于荧光共振能量转移的stopped-flow技术,分析DePif1对不同底物(G4-DNA with 5′26nt tail和dsDNA with 5′26nt tail)的解旋活性。【结果】每升菌液可获得9 mg纯度大于95%的DePif1解旋酶。DePif1结合不同DNA底物的强度依次为G4-DNA>单链DNA>双链DNA,其对G4-DNA的解旋活力大于双链DNA。【结论】成功表达并纯化了嗜热脱铁去硫弧菌Pif1解旋酶,并证明其具有特异的G4-DNA结合和解旋能力。

热脱硫弧菌解旋酶基因TyPif1的原核表达、纯化及功能分析

【目的】通过原核表达系统获得热脱硫弧菌（Thermodesulfovibrio yellowstonii H.）Pif1解旋酶（TyPif1）,研究TyPif1解旋酶的嗜热特性和解旋机理。【方法】将Typif1解旋酶编码区和SUMO促溶标签编码区融合连入pET15b获得重组表达载体pET15b-SUMO-TyPif1,将该重组载体导入大肠杆菌BL21（DE3）菌株诱导表达,经Ni-NTA柱亲和纯化获得融合蛋白,SUMO蛋白酶切除标签,再经Ni-NTA柱去除标签蛋白及SUMO蛋白酶,经Heparin柱进一步纯化最终获得TyPif1全长蛋白。通过荧光各向异性、圆二色谱（CD）和荧光共振能量转移（FRET）分析TyPif1解旋酶的DNA结合活性、解旋活性以及二级结构的热稳定性。【结果】获得了纯度大于95%的TyPif1蛋白,1L培养基可以获得约10mg纯度大于95%的蛋白;TyPif1解旋酶结合单链DNA和G4DNA的活性明显高于双链DNA;TyPif1具有较高的解旋G4DNA的活性,在25~60℃下其二级结构相对稳定,且解旋速率随温度升高而增大,25~50℃TyPif1的解旋速率由0.09s-1增大到0.23s-1。【结论】表达纯化了热脱硫弧菌TyPif1解旋酶,其不仅具有良好的热稳定性,同时具有特异的结合和解旋G4DNA的能力。

嗜热厌氧杆菌Ana.Pif1解旋酶核心结构域蛋白与DNA底物结合的反应特性

目的:探究嗜热厌氧杆菌的Ana. Pif1解旋酶核心结构域蛋白(Ana. Pif1-HD)与DNA底物结合的反应特性。方法:利用DNAman、Cluxtal X等软件,对Ana. Pif1的核心结构域蛋白进行系统进化树分析与同源序列比对; Ana. Pif1-HD表达载体构建后转入大肠杆菌进行原核表达,并通过Ni-NTA、SUMO酶切、S200分子筛等层析柱纯化获得Ana. Pif1-HD蛋白;利用Stopped-flow FRET技术监测Ana. Pif1-HD蛋白的解旋活性,利用荧光偏振检测技术分析Ana. Pif1-HD与不同长度、不同结构DNA底物的结合反应各向异性值,并进行拟合分析与统计。结果:Ana. Pif1的核心结构域蛋白为靠近N-端的448氨基酸,通过原核表达与纯化获得纯度为97%、浓度为5 g/L的Ana. Pif1-HD蛋白,并利用Stopped-flow FRET与荧光偏振等技术验证其具有Ana. Pif1全长蛋白90%的解旋活性与95%的结合活性; Ana. Pif1-HD的最佳结合反应条件是42℃在pH 6. 0含20 mmol/L Na Cl及3 mmol/L MgCl2的溶液中进行; Ana. Pif1-HD与不同长度ss DNA底物结合时的解离速率常数递增,并明确其ssDNA的binding-size为10. 34 nt;研究首次揭示Ana. Pif1-HD与不同复制中间体DNA结合反应的底物特异性ssG4 DNA> G4 DNA> 3'-ssDNA-dsDNA≈Y-型>其它底物。结论:成功表达纯化具有全长活性的Ana. Pif1解旋酶核心结构域蛋白,首次揭示该解旋酶核心蛋白与各类不同DNA底物的结合反应特性。

DDX21 RNA解旋酶不同结构域的功能特点解析

DEAD-box家族是在生物体内普遍存在的一类高度保守的RNA解旋酶,在RNA的合成和加工、细胞发育和细胞代谢等过程中都发挥着重要作用。DDX21 RNA解旋酶是DEAD-box家族成员之一,而目前为止DDX21的酶学功能及结构特征尚未被完全了解。本研究运用生物化学与生物物理学前沿技术,系统地研究了DDX21各结构域在不同功能中发挥的作用。首先重组构建并纯化了人的DDX21 RNA解旋酶及不同的截短蛋白质,利用动态激光散射和凝胶层析技术分析各蛋白质的寡聚形态,发现N-端的非功能区(N-端181aa)与C-端的4个FRGQR重复结构域对其结构有较大的影响;利用荧光偏振技术比较分析了各蛋白质与单链RNA的结合反应,结果显示,仅保留DEADc和HELICc结构域的截短蛋白质与单链RNA完全没有亲和性,缺失N-端181aa的截短蛋白质对ssRNA的结合能力与全长蛋白质基本一致,而仅缺失C-端的4个重复FRGQR结构域的截短蛋白质与单链RNA的亲和能力将显著下降;利用快速停流检测技术分析各截短蛋白质的解旋及退火活性,发现DEADc、HELICc及GUCT_RHII三个结构域共同参与DDX21的解旋功能,另一方面,缺失C-端4个FRGQR重复结构域的截短蛋白质导致退火能力的丧失。本研究揭示了DDX21的GUCT_RHII结构域及C-端4个FRGQR重复结构域在其结构及功能中发挥的重要作用,为今后研究DDX21的结构及其细胞功能提供了重要的理论依据。

牛DHX36解旋酶及其突变体底物结合与解旋活性研究

【目的】研究牛(Bos taurus)解旋酶DHX36(BtDHX36)及其突变体蛋白对含有G4结构底物结合和解旋活性的差异,为深入研究牛DHX36酶学特征和结构提供理论参考。【方法】制备底物16nt-ssDNA、Telomere G4和Telomere G4-16T,构建重组质粒pET15b-sumo-BtDHX36,通过Overlap PCR引入点突变,构建位于RSM区和OB域的突变重组质粒,分别将质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)菌株中诱导表达;经过Ni-NTA和Hi Trap SP HP柱纯化得到目的蛋白。以解离平衡常数为判定指标,利用荧光各向异性法(FA)对酶蛋白与底物结合时的KCl浓度(0,50和100 mmol/L)、反应温度(25,30和37℃)、MgCl 2浓度(0,2和5 mmol/L)、pH(6.5,7.5和8.5)进行优化,确定BtDHX36的体外最佳底物结合条件,比较野生型BtDHX36及其突变体对含有G4结构底物结合活性的差异。以解旋比例和速率常数为判定指标,利用快速停流-荧光共振能量转移(FRET)技术,比较野生型BtDHX36及其突变体对G4结构的解旋活性差异。【结果】成功构建了野生型BtDHX36重组质粒pET15b-sumo-BtDHX36及其RSM区突变体BtDHX36 R63AI65A、BtDHX36 Y69A、BtDHX36 K76AN77AK78A和OB域突变体BtDHX36 Y862A的重组质粒,诱导表达纯化后得到了纯度大于95%的酶蛋白。确定了野生型BtDHX36的体外最佳底物结合条件为:KCl 50 mmol/L、MgCl 22 mmol/L、20 mmol/L Tris-HCl pH=7.5、反应温度37℃。各突变位点均可降低酶蛋白与Telomere G4的结合活性。OB域的Y862A突变和RSM区K76AN77AK78A突变对酶蛋白解旋Telomere G4-16T活性均无明显影响;RSM区的R63AI65A和Y69A突变对酶蛋白解旋Telomere G4-16T均有较大影响。【结论】获得了高纯度的野生型BtDHX36及突变体酶蛋白,明晰了其体外最佳底物结合条件;RSM区的R63AI65A和Y69A突变均可明显降低酶蛋白解旋Telomere G4-16T的活性。

牛RECQL解旋酶的原核表达纯化及解旋条件优化

【目的】通过大肠杆菌表达纯化牛(Bos taurus)RECQL蛋白,利用停流光谱技术对解旋条件进行优化,为研究RECQL的酶促反应动力过程奠定基础。【方法】将人工合成的牛RECQL蛋白编码序列与pET21a载体相连接,获得重组表达载体pET21a-BtRecql后,将其导入大肠杆菌BL21(DE3)菌株中进行诱导表达,经过Ni-NTA亲和层析和Superdex 200凝胶过滤层析,得到纯化的重组蛋白BtRECQL;再利用停流光谱技术对BtRECQL解旋过程进行检测分析,通过摸索不同的试验参数找到BtRECQL发挥解旋功能较适宜的条件。【结果】得到了纯度大于95%的BtRECQL蛋白,产量为0.29 mg/L。在BtRECQL浓度为60nmol/L,反应条件为1.0 mmol/L ATP,30mmol/L Tris-HCl,pH 7.5,60mmol/L NaCl,1mmol/L MgCl2,2mmol/L DTT,孵育温度为37℃时,该蛋白解旋活性较好。【结论】成功表达并纯化了BtRECQL蛋白,确定了其最优的解旋条件。

超声对鸡腿菇多糖结构及生物活性的影响

超声提取技术对多糖结构和生物活性的影响具有重要的生物学意义和潜在的应用价值.研究了超声对鸡腿菇多糖结构和生物活性的影响机理.通过HPLC,GC,GC-MS等技术鉴定了热水提取鸡腿菇多糖(WCP3a)和超声波提取鸡腿菇多糖(UCP3a)的一级结构,采用邻苯三酚自氧化法检测了二者的体外抗氧化活性,并对两者一级结构及生物活性的异同进行了比较.结果显示,(1)WCP3a的单糖组成为甘露糖、葡萄糖和半乳糖三种,而UCP3a的单糖组成为甘露糖和葡萄糖两种;(2)WCP3a的糖苷键型为1→4,6甘露糖、1→甘露糖、1→3葡萄糖和1→2,6半乳糖;UCP3a的糖苷键型为1→4,6甘露糖、1→甘露糖、1→3葡萄糖和1→4葡萄糖;(3)WCP3a和UCP3a均能有效清除超氧阴离子,并且UCP3a对超氧阴离子的清除效果更显著;(4)首次发现超声波可引起化学断键及原子重排,导致多糖的组成单位单糖结构发生变化——半乳糖转化为葡萄糖,其转化率随超声功率呈先增大后减小的趋势;随着超声时间的延长,转化率同样呈先增大后减小的趋势.

嗜热细菌Anaerobaculum hydrogeniforman Pif1解旋酶的异源表达与解旋反应特性

【目的】原核表达与纯化源自嗜热细菌Anaerobaculum hydrogeniforman的Pif1解旋酶,从而探究其解旋反应特性。【方法】将重组载体pET21a-AnaPif1-TEV/SUMO导入大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,并进行Ni-NTA亲和层析、Superdex200凝胶过滤层析等一系列纯化手段;再利用快速停留监测技术系统地研究Ana.Pif1的解旋反应特性,包括解旋极性、最佳ATP浓度、最佳金属辅因子、最佳解旋温度以及解旋复制中间体DNA的底物特异性。【结果】通过异源表达与纯化,获得了无任何标签序列、分子量59 kDa的Ana.Pif1蛋白,纯度达97%,产率为9.5 mg/L。本研究首先验证Ana.Pif1具有5''-3''的解旋极性,并发现其解旋反应最佳ATP浓度为2 mmol/L,其最佳二价金属辅因子为Mg^(2+),最适反应温度为55°C。解旋复制中间体的底物特异性显示,Y-S型复制叉的解旋速率最高,为0.127s^(–1);而12 nt-bubble底物的解旋幅度最大,达到78.8%;暗示这些底物可能是Ana.Pif1的天然底物。【结论】本文首次较为系统地分析了Ana.Pif1解旋酶的解旋反应特性,为阐明此类嗜热细菌Pif1解旋酶的分子作用机制奠定了基础。