具有谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）活力的抗体酶研究──单克隆抗体的制备及化学诱变

将２，４－二硝基氯苯（ＤＮＣＢ）专一地与底物谷胱甘肽（ＧＳＨ）巯基反应，合成了半抗原ＧＳＨ－Ｓ－ＤＮＰ；通过蛋白质连接技术（戊二醛法）将此半抗原偶联到牛血清白蛋白（ＢＳＡ）上，制备出全抗原。用吸收光谱测得每个ＢＳＡ分子上平均连接３３个半抗原。用全抗原免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，通过淋巴细胞杂交瘤技术，制备出抗ＧＳＨ的单克隆抗体杂交瘤细胞系４Ａ４、６Ａ６、１Ｃ８和４Ｇ３等。将其中的４Ａ４培养上清经５０％（ＮＨ４）２ＳＯ４沉淀、ＤＥＡＥ－５２纤维素离子交换柱层析和ＢｉｏｇｅｌＰ－２００凝胶过滤分离得到４Ａ４ＩｇＧ抗体，经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检验纯度大于９０％。４Ａ４ＩｇＧ可变区中的丝氨酸（Ｓｅｒ）经苯甲基磺酰氟（ＰＭＳＦ）活化，再用硒化氢（Ｈ２Ｓｅ）处理，则Ｓｅｒ转变成硒代半胱氨酸（ＳｅＣｙｓ），使４Ａ４ＩｇＧ引入该催化基因。化学诱变后的４Ａ４ＩｇＧ具有谷胱甘肽过氧化物酶（ＧＰＸ）活性，其活力是世界上最好的ＧＰＸ模拟物ＰＺ５１的１１００倍，是游离ＳｅＣｙｓ的２．２×１０４倍，已达到天然酶活力的数量级水平。经初步应用，该抗体酶可防止自由基对心肌线粒体的损伤。

大肠杆菌耐热性肠毒素Ⅰ融合基因的构建及其免疫原性研究

用限制性核酸内切酶ＢａｍＨＩ和Ｂｇ１Ⅱ双酶切质粒ｐＢＳＴ２－６，获得了大肠杆菌耐热性肠毒素Ⅰ（ＳＴ１）基因，再将含ＬａｃＺ基因（编码β－半乳糖苷酶）的载体ｐＵＣ１８用ＢａｍＨＩ酶切、碱性磷酸酶处理，然后与ＳＴ１基因通过Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接，转化至受体菌ＤＨ５α中。通过菌落原位杂交筛选，共筛选出５３个ＳＴ１基因探针杂交阳性的重组子，对其中一个重组子ＤＨ５α（ｐＸＳＴ１）进行限制性核酸内切酶酶切分析和核苷酸序列分析，证明重组质粒ｐＸＳＴ１含有２个正向串连在一起的ＳＴ１基因，而且融合在ＬａｃＺ基因的上游，具有正确的阅读框架。又ＤＨ５α（ｐＸＳＴ１）菌株能在含Ｘ－Ｇａｌ的ＬＢ平板上长成蓝色菌落，而且ＥＬＩＳＡ也检测到ＳＴ１融合蛋白，这表明该菌株能表达具有β－半乳糖苷酶活性的大肠杆菌ＳＴ１—β－半乳糖苷酶融合蛋白。免疫实验结果表明，重组菌株ＤＨ５α（ｐＸＳＴ１）安全无毒，表达的ＳＴ１融合蛋白能够诱发ＢＡＬＢ／ｃ鼠产生抗体，该抗体具有中和天然ＳＴ１肠毒素的毒性作用，这表明ＤＨ５α（ｐＸＴ１）可以作为预防幼畜腹泻的菌苗候选株。

应用A蛋白亲和层析法纯化单克隆抗体

应用Protein A亲和层析法,从采集的小鼠腹水中纯化出了抗凝血因子Ⅶ单克隆抗体,用SDS-PAGE和ELISA法分别检测了纯化后单克隆抗体的纯度及效价,结果显示,电泳为两条带,分别为免疫球蛋白G(IgG)的重链和轻链,纯化后的单克隆抗体纯度达到电泳纯,应用间接ELISA法测定腹水效价为1×10-7左右,与未纯化前无差异。结果表明,应用A蛋白亲和层析法能够得到纯度较高的单克隆抗体,适用于高纯度单克隆抗体的制备。

绿脓杆菌外毒素A受体结合亚单位基因的克隆与表达

为防治绿脓杆菌感染造成的细胞坏死及多器官衰竭，本试验克隆了含绿脓杆菌外毒素Ａ（ＰＥＡ）结合亚单位（Ⅰ区）和部分跨膜亚单位（Ⅱ区）编码３０９个氨基酸的约１０００ｂｐ的基因片段，以正确阅读框架将该片段置于原核高效表达Ｔ７启动子下游，构建了高效表达质粒ｐＥＴ－ＥＡＢ。转化宿主菌ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）、ＨＭ１７４（ＤＥ３）ｐｌｙｓＳ和ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐｌｙｓＳ后，经ＩＰＴＧ诱导４ｈ，均表达了外源目的基因蛋白，其中ＢＬ２１（ＤＥ３）和ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐｌｙｓＳ的表达量明显高于其他宿主菌。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，外源蛋白分子量约３４０００，与ＰＥＡⅠ区和部分Ⅱ区基因所编码的蛋白理论估计值相符，命名为ＰＥ３４。凝胶薄层扫描显示，ＰＥ３４含量占菌体蛋白总量的５６％。

大肠杆菌耐热性肠毒素Ⅰ基因核苷酸序列分析与免疫原性研究

对构建的重组质粒ｐＸＳＴ１（含有耐热性肠毒素ＳＴ１和ＬａｃＺ基因）进行核苷酸序列分析的结果表明，该质粒中含有２个正向串联在一起的ＳＴ１基因，且融合在ＬａｃＺ基因的上游，具有正确的阅读框架。免疫学试验结果表明，构建的ＤＨ５α（ｐＸＳＴ１）重组菌株安全无毒。该重组菌株表达的ＳＴ１融合蛋白能够诱发ＢＡＬＢ／ｃ鼠产生抗体，且抗体能中和天然肠毒素ＳＴ１活性，具有较好的免疫保护作用。由此表明。

抗人红细胞膜抗原非凝集型单克隆抗体的研制及特性鉴定

目的:制备抗人红细胞膜抗原的非凝集型单克隆抗体(mAb)并鉴定其特性。方法:应用杂交瘤技术,以人O型红细胞膜抗原免疫BALB/c小鼠。取免疫小鼠的脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合,用聚凝胺试管法筛选识别红细胞表面共同抗原的抗体,玻片凝集实验剔除凝集型抗体(完全抗体),再将分泌非凝集型mAb(不完全抗体)的杂交瘤细胞株用有限稀释法克隆化3次。对杂交瘤细胞的稳定性和mAb的特性进行鉴定。结果:获得1株可稳定分泌mAb的杂交瘤细胞2E8。mAb2E8为IgG1类,可特异性地识别红细胞膜上的H抗原,没有种属交叉血凝反应。杂交瘤细胞的培养上清与人的A、B、AB和O型红细胞均能产生强凝集,凝集效价为1∶1024,腹水mAb的凝集效价达到1∶64×106。mAb的亲和力用凝集试验检测,出现血凝的时间为7s,3min以内凝块>1mm。结论:成功地制备了针对红细胞膜H抗原的非凝集性mAb,此mAb的凝集效价、相对亲和力及特异性均较良好,为构建双特异性抗体奠定了基础。

大肠杆菌肠毒素ST_(1b)基因的亚克隆及其核苷酸序列分析

以大肠杆菌pSLM004菌株为始发菌株,利用合成的一对与ST_1基因特定序列相匹配的引物,通过PCR扩增出了ST_(1b)基因。该基因片段扩增物经适当纯化,与克隆载体pUC18的HincⅡ切点平端连接,转化到受体菌JM101中。利用Ap抗性作为压力选择标志以及LacZ基因插入失活显色反应,在Ap/Xgal-IPTG培养基上,筛选出转化子。将白色菌落转化子经酚/氯仿法抽提重组质粒,利用所扩增ST_(1b)基因片段上所设计的BglⅡ位点及pUC18载体具有的PvuⅡ切点,经酶切反应鉴定重组子,得到了理想重组子pBST2-6。该重组质粒经双脱氧法双向核苷酸序列分析,确定了插入的ST_(1b)基因与载体的连接向位及其全部核苷酸序列。

K_99和ST_1双价保护性抗原基因重组菌株的表达及其免疫原性研究

大肠杆菌耐热性肠毒素(ST_1)是引起幼畜腹泻的重要毒力因子之一,其结构基因编码19个氨基酸,无免疫原性。作者以pSLM_(004)工程菌株为始发菌株,亚克隆ST_1基因,并将ST_1基因分别重组到能有效表达K_(99)菌毛抗原的pGK_(99)之K_(99)基因(pSK_(219))和pUC_(18)多克隆位点中(pXST系列)。从而成功构建了能表达ST_1-K_(99)两种抗原的工程菌苗候选株pSK_(219)以及能表达ST_1抗原的工程菌株pXST。利用这两种基因重组株的表达产物制备了免疫原。经BALB/c鼠免疫效果研究证实,所构建的pS_(219)菌苗候选株安全无毒,且pSK_(219)中K_(99)基因赋于ST_1基因免疫原性。pSK_(219)免疫接种鼠血清及其初乳均可中和ST_1毒性(1个鼠单位),具有较好的免疫保护作用。pSK_(219)工程菌株作为菌苗候选株,为幼畜大肠杆菌性腹泻多价工程菌苗的研制奠定了基础。

具有GPX活性的单克隆抗体可变区基因的克隆和序列分析

目的利用分泌具有GPX活性的单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞3G5,克隆其mAb体的可变区基因。方法提取杂交瘤细胞的总RNA ,分离mRNA ,反转录合成cDNA。经PCR扩增VH 基因和VL 基因 ,将VH 基因和VL基因与载体 pGEM T连接后 ,进行酶切鉴定和序列分析。结果构建了2个分别含有VH 和VL 基因的重组质粒。序列分析表明 ,VH 和VL 分别属于mouscheavychainsubgroupIII和mouselightchainsubgroupV亚群 ,长度为372和324bp ,编码124和108个氨基酸 ,在高变区分别有4和2个丝氨酸。结论克隆的VH 和VL 基因符合功能性重排的鼠抗体可变区基因特征 ,为将来制备具有GPX活性的单链抗体提供了可靠的基因材料。

绿脓杆菌外毒素A的纯化

用绿脓杆菌ＰＡ１０３株接种于ＴＳＡ甘油培养基３２℃培养，产生绿脓杆菌外毒素Ａ（ＰＥＡ），经流水透析除盐、ＤＥ－５２纤维素阶段洗脱、硫酸铵分级沉淀、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－２５除盐、ＤＥ－５２纤维素梯度洗脱、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－２００分子筛层析，纯化了绿脓杆菌外毒素Ａ。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，纯化后的毒素为单一蛋白带，分子量约６６０００；对普通小鼠ＬＤ５０为０．２４μｇ蛋白。用ＰＥＡ抗血清作免疫印迹分析，进一步证实纯化的蛋白为ＰＥＡ，毒素约纯化了５００倍，总蛋白回收率约０．０２４％，毒素回收率约１１％。

具有谷胱甘肽过氧化物酶活性的含硒单链抗体酶制备

利用RT PCR从分泌有谷胱甘肽结合部位的单克隆抗体杂交瘤细胞株 2F3中 ,扩增出单抗重链可变区和轻链可变区基因 .经DNA测序后 ,用Linker(Gly4 Ser1) 3 构建成单链抗体 (scFv)表达载体pTMF scFv ,将重组质粒pTMF scFv转化到大肠杆菌BL2 1(DE3) ,实现了单链抗体的高效表达 .表达的单链抗体占菌体总蛋白 2 5%～ 30 % .该重组蛋白以包涵体形式存在 ,分子量为 30kD .经过金属螯合亲和层析纯化、复性和凝胶过滤纯化 ,得到电泳均一的单链抗体 .再经化学诱变 ,得到含硒单链抗体酶 ,其谷胱甘肽过氧化物酶活性为 330 0U μmol.

大肠杆菌耐热性肠毒素ST_1/K99/LacZ基因重组的研究

将构建的ｐＢＳＴ２～６工程菌质粒用限制性内切酶ＢａｍＨＩ／ＢｇｌⅡ酶切，经琼脂糖凝胶电泳和电洗脱，回收１４７ｂｐ的目的ＳＴ１基因。随之将该基因分别重组到能有效表达Ｋ９９菌毛抗原和ＬａｃＺ酶的ｐＧＫ９９之Ｋ９９基因ＢｇｌⅡ位点和ｐＵＣ１８的ＢａｍＨＩ位点中。通过ＳＴ１基因探针菌落原位杂交、特定酶切分析及ＤＮＡ序列分析，筛选并鉴定出了理想重组子，从而构建出了能分别表达ＳＴ１融合基因产物的工程菌株ｐＳＫ２１９和ｐＸＳＴ１。

绿脓杆菌外毒素ArecA基因的融合及融合蛋白的表达

将绿脓杆菌ｒｅｃＡ基因克隆到ｐＵＣ１８中，构建了中间载体ｐＵＣＲ１８；然后以正确的向位及阅读框架将ｒｅｃＡ基因亚克隆到毒性基因缺失的绿脓杆菌外毒素Ａ（ＰＥＡ）基因中，构建了ＰＥＡ－ｒｅｃＡ融合基因质粒ｐＥＲＡ；融合基因经ＢａｍＨＩ及ＥｃｏＲＩ酶切，以正确阅读框架插入带有Ｔ７表达启动子的质粒ｐＥＴ－１７ｂ，构建了可表达ＰＥＡ－ｒｅｃＡ融合基因的质粒ｐＥＲＡ－１７ｂ。经酶切分析及ＰＣＲ扩增检测证明，绿脓杆菌ｒｅｃＡ已插入ＰＥＡ毒性基因中。ｐＥＲＡ－１７ｂ转化到ＤＥ３溶原态大肠杆菌ＨＭＳ１７４中，经ＩＰＴＧ诱导，表达了ＰＥＡ－ＲｅｃＡ蛋白。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和凝胶薄层扫描ＰＥＡ－ＲｅｃＡ蛋白，表明ＰＥＡ－ＲｅｃＡ的分子量约为９００００，与理论推算相符，表达率占菌体总蛋白量３．４２９％，用ＰＥＡ抗血清和抗ＲｅｃＡ单克隆抗体作免疫印迹分析。

抗-D抗体及其应用

Rh血型是仅次于ABO血型系统的人类红细胞抗原系统,至今已发现40多种抗原,但与临床密切相关的是D、C、c、E、e等5种抗原,其中最主要的是D抗原。相应的抗-D抗体无论是在临床输血检测,还是在Rh(D)新生儿溶血病、溶血性输血反应等的防治方面均具有非常重要的意义。传统的抗-D抗体的制备需用人的血清,来源受限。各种抗-D人源性单克隆抗体和基因工程抗体已经成为发展方向。

人凝血因子Ⅶ单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备抗人凝血因子Ⅶ单克隆抗体并鉴定其特性。方法:应用杂交瘤融合技术,以重组人凝血因子Ⅶ为抗原免疫BALB/c小鼠;取免疫小鼠的脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合,经间接ELISA法筛选、融合细胞有限稀释法克隆、克隆化杂交瘤细胞株的亚类鉴定等方法筛选出单克隆抗体杂交瘤细胞株,并对单克隆抗体的特异性进行鉴定;用杂交瘤细胞株诱生小鼠腹水,应用蛋白A亲和层析法进行单抗的纯化。结果:获得了3株可稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞3E8、3D2和1C5,诱生的腹水效价分别为1∶1×107、1∶1×106和1∶1×106;亚类鉴定表明3B8为IgG2a,其余2株均为IgG1;特异性鉴定显示它们与多种血浆蛋白均无交叉反应,表明单抗是特异的;经过亲和层析,获得了纯化的单抗。结论:获得了特异性的人凝血因子Ⅶ单克隆抗体,为建立人凝血因子Ⅶ检测及纯化方法奠定了基础。

应用蛋白质工程法制备含硒单链抗体酶

目的 制备一种具有谷胱甘肽过氧化物酬（ＧＰＸ）活性的含硒单链抗体酶。方法 利用ＲＴ－ＰＣＲ方 法从杂交瘤细胞株２Ｆ３中扩增出单克隆抗体重链可变区和轻链可变区基因。经ＤＮＡ序列测定后，构建成表达载体 ｐＴＭＦ－ｓｃＦｖ，经过金属螯合层析纯化、复性和化学诱变，得到含硒单链抗体酶。结果 将重组质粒ｐＴＭＦ－ｓｃＦｖ分别转 化入大肠杆菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）和 ＢＬ２１（ｃｏｄｅｎ ｐｌｕｓ），表达目的蛋白分别占菌体总蛋白的５％－１０％、１５％－ ２０％和 ２５％－３０％。该重组蛋白以包涵体形式存在，相对分子质量为３００００。其 ＧＰＸ活性为３４００Ｕ／μｍｏｌ，接近天 然酌水平。结论 为工业化制备含硒单链抗体酶奠定基础。

谷胱甘肽过氧化物抗体酶ScFv的基因构建

特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株５Ｃ９所分泌的ＭｃＡｂ经化学修饰后，其抗体酶活性比兔肝谷胱甘肽过氧化物酶活性高２．６倍。在所建成的杂交瘤细胞株基础上，通过提取该细胞总ＲＮＡ，分离ｍＲＮＡ，反转录合成ｃＤＮＡ，以及ＶＨ和ＶＬ基因的ＰＣＲ扩增、组装，成功地构建了谷胱甘肽过氧化物抗体酶ＳｃＦｖ基因。电泳分析证明，ＶＨ和ＶＬ基因长度分别为３４０ｂｐ和３２５ｂｐ；所构建的ＳｃＦｖ基因长度约为７５０ｂｐ，并带有ＳｆｉⅠ和ＮｏｔⅠ切点，可用于ＳｃＦｖ的基因重组及其表达。

大肠杆菌耐热性肠毒素ST_(1b)基因的亚克隆、重组及其核苷酸序列分析

产肠毒素性大肠杆菌（ETEC）是幼畜、婴幼儿及旅游者腹泻的重要病原菌之一。作者以大肠杆菌pSLM004菌株为始发菌株,利用合成的一对与ST1基因特定序列相匹配的引物,通过PCR扩增出了ST1b基因。该基因片段扩增物（150bp）经适当方法纯化,与克隆载体pUC18的HlincⅡ位点平端连接,转化到受体菌JM101中。

绿脓杆菌外毒素A受体结合亚单位基因的克隆与表达

绿脓杆菌外毒素A(PEA)是绿脓杆菌感染的最主要致病因子,它由3个区域共613个氨基酸组成,分子质量66 ku。在体内,毒素先由Ⅰ区(受体结合亚单位)识别细胞表面受体并与之结合,而后,通过Ⅱ区(跨膜亚单位)将具有ADP-核糖基化活性的毒性单位导入胞浆,使Ⅲ区(毒力亚单位)发挥毒力作用,催化细胞内的延长因子2(EF-2)发生ADP-核糖基化反应,使EF-2灭活,抑制蛋白合成而杀灭细胞。在这种结合、入胞。