克隆山羊成纤维细胞IGF2-H19基因座甲基化分析

旨在研究山羊体细胞核移植对克隆后代成纤维细胞IGF2-H19基因座甲基化的影响。以奶山羊耳成纤维细胞(GFC,对照组)和克隆山羊耳成纤维细胞(CFC,试验组)为试验材料,培养至第5代时,采用细胞计数法绘制细胞生长曲线,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,实时荧光定量PCR分析基因的表达差异,亚硫酸氢盐测序(BSP)分析差异甲基化区域的甲基化水平。结果显示,GFC和CFC组细胞的生长曲线均呈典型"S"型,但CFC组细胞的凋亡率显著高于GFC组(P<0.01);CFC组细胞中Dnmt1(P<0.01)、Dnmt3b(P<0.01)、Tet1(P<0.05)、Tet2(P<0.05)、H19(P<0.05)和IGF2(P<0.01)基因表达水平均显著低于GFC组,而Tet3、Dnmt3a和IGF2R在2组间无显著性差异;CFC组细胞中IGF2两个差异甲基化区域(DMR1和DMR2)的甲基化水平均显著低于GFC组(74.1%vs.57.8%,P<0.01;76.8%vs.40.0%,P<0.01),但IGF2-H19印记基因控制区域甲基化水平显著高于GFC组(68.8%vs.84.0%,P<0.01)。体细胞核移植通过影响Dnmt和Tet家族基因的表达引起IGF2-H19基因座甲基化的异常,导致基因印记紊乱,进而影响再克隆的效率。

不同益生菌对断奶山羊生长性能、血清生化指标以及粪便菌群的影响

本试验旨在研究枯草芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌单独饲喂与联合饲喂对断奶山羊生长性能、腹泻率、血清生化指标以及粪便菌群的影响。选取60只3月龄海门山羊,随机分为4组,每组3个重复,每个重复5只羊。对照组(C组)饲喂基础饲粮;枯草芽孢杆菌组(BS组)饲喂基础饲粮+400 mg/kg的枯草芽孢杆菌(有效活菌数为1×10^(11) CFU/g);地衣芽孢杆菌组(BL组)饲喂基础饲粮+400 mg/kg的地衣芽孢杆菌(有效活菌数为1×10^(11) CFU/g);联合饲喂组(BS_BL组)饲喂基础饲粮+400 mg/kg的枯草芽孢杆菌+400 mg/kg的地衣芽孢杆菌(有效活菌数为1×10^(11) CFU/g)。预试期10 d,正试期30 d。结果表明:1)试验第10天,BS_BL组断奶山羊的体重极显著高于C组、BS组与BL组(P<0.01);试验第30天,C组、BS组、BL组与BS_BL组的断奶山羊的体重无显著差异(P>0.05);试验第1~10天,BS_BL组的平均日增重(ADG)极显著高于C组、BS组与BL组(P<0.01);试验第21~30天,BL组与BS_BL组的ADG极显著高于C组与BS组(P<0.01);试验第1~30天,试验组与C组的ADG无显著差异(P>0.05);试验第21~30天,BS_BL组的平均日采食量(ADFI)极显著高于C组、BS组与BL组(P<0.01);试验第1~30天,BS_BL组的ADFI显著高于C组、BS组与BL组(P<0.05);试验第1~30天,试验组与C组的料重比(F/G)差异不显著(P>0.05)。2)试验第1~10天、第11~20天,BS组、BL组与BS_BL组的腹泻率显著低于C组(P<0.05);第1~30天,BS_BL组的腹泻率显著低于C组(P<0.05)。3)试验第30天,BS组的血清葡萄糖(GLU)含量、碱性磷酸酶(ALP)和乳酸脱氢酶(LDH)活性显著低于C组(P<0.05),血清谷草转氨酶(AST)活性和白蛋白(ALB)含量极显著低于C组(P<0.01);BL组血清尿素氮(UN)含量显著高于C组(P<0.05),BS_BL组血清AST活性和GLU含量显著低于C组(P<0.05)。4)粪便进行16S rDNA测序发现,Chao1和observed-species指数显示BS_BL组所含物种数目较多,Shannon和Simpson指数显示BS_BL组多样性高。C组细菌的优势菌门为变形菌门、拟杆菌门、放线菌门;BS组细菌的优势菌门为放线菌门、变形菌门、拟杆菌门;BL组细菌的优势菌门为拟杆菌门、变形菌门、浮霉菌门;BS_BL组细菌的优势菌门为拟杆菌门、变形菌门、厚壁菌门。C组细菌的优势菌属为堆囊菌属、土地杆菌属、球孢菌属;BS组细菌的优势菌属为野野村菌属、嗜红杆菌属、堆囊菌属;BL组细菌的优势菌属为副足杆菌属、野野村菌属、扁平菌属;BS_BL组细菌的优势菌属为Marinilabiliaceae_unclassified、假单胞菌属、Clostridiales_vadinBB60_group_unclassified。综上所述,枯草芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌联合饲喂能显著提高断奶山羊的生长性能,降低腹泻率,改善血清生化指标,改变粪便菌群的多样性以及丰富度。

干扰EZH2的表达对奶山羊精原干细胞抗氧化能力的影响

[目的]本试验旨在探究EZH2对奶山羊精原干细胞抗氧化能力的影响。[方法]通过siRNA干扰EZH2在奶山羊精原干细胞中的表达,验证干扰效率,并采用ELISA、qPCR和Western blot检测抗氧化酶活性和抗氧化相关基因与蛋白表达水平。[结果]与对照组相比,干扰EZH2极显著提高奶山羊精原干细胞中过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)的活性(P<0.01),而丙二醛(MDA)含量极显著下降(P<0.01)。在分子水平上,干扰EZH2后,奶山羊精原干细胞中CAT、SOD2蛋白和mRNA表达水平均极显著提高(P<0.01),GPx mRNA表达水平极显著上升(P<0.01)。[结论]在体外培养的奶山羊精原干细胞中,干扰EZH2增强了细胞的抗氧化能力,其分子机制可能与激活CAT和SOD2蛋白并促进其下游抗氧化基因GPx表达相关。

不同发育阶段湖羊生殖器官脂联素受体与睾酮分泌关键基因表达模式及相关性研究

旨在探究不同发育阶段湖羊生殖器官中脂联素受体(adiponectin receptor,AdpR)及睾酮(testosterone,T)分泌相关基因mRNA的表达变化及相关性分析。选取3、9、24月龄(M)湖羊各5只,颈静脉采血并收集血清,屠宰后,采集下丘脑、垂体、睾丸、附睾头、体、尾组织;ELISA技术检测各月龄湖羊血清中脂联素(adiponectin,Adp)、T、促性腺激素释放激素(gonadotropin releasing hormone,GnRH)、促性腺激素抑制激素(gonadotropin inhibitory hormone,GnIH)浓度;qRT-PCT技术检测不同发育阶段湖羊下丘脑-垂体-性腺轴(hypothalamus-pituitary-gonad axis,HPG)中AdpR1和AdpR2及T分泌关键基因mRNA表达规律;免疫组化技术对AdpR1在湖羊睾丸和附睾中进行定位分析。结果表明:不同发育阶段湖羊血清中Adp、GnRH、GnIH浓度呈现不同的变化趋势,其中Adp含量在性成熟后(9和24月龄)显著高于性成熟前(3月龄)(P<0.05)。AdpR1mRNA表达量在各个月龄睾丸和附睾尾中均显著高于AdpR2(P<0.05),其中AdpR1mRNA表达量在二者中呈上升趋势,且差异显著(P<0.05),而在附睾头、体差异不显著(P>0.05)。AdpR1存在于睾丸间质细胞、生精细胞、曲精细管管壁肌样细胞、精子细胞以及附睾头、体、尾的上皮细胞。血清中Adp与T含量呈显著正相关(P<0.05);Adp含量与GnIH负相关以及与GnRH正相关,但差异不显著(P>0.05);AdpR1mRNA表达水平与StAR、3β-HSD mRNA表达水平呈显著正相关(P<0.05)。综上表明,在湖羊生殖器官发育过程中,Adp通过与其受体AdpR1结合,促进T的产生,进而影响湖羊睾丸发育。

GALNTL5基因在不同月龄湖羊附睾中的表达模式及其miRNA的预测

[目的]本文旨在探究不同发育阶段湖羊附睾(头、体、尾)中GALNTL5(polypeptide N-acetylgalactosaminyltransferase-like protein 5)的表达规律及其microRNA(miRNA)预测。[方法]选取3、9、24月龄(M)雄性湖羊各5只,屠宰后采集附睾(头、体、尾)组织。采用RT-qPCR和Western blot技术检测不同发育阶段湖羊附睾中GALNTL5 mRNA和蛋白表达水平;用免疫组化技术对其进行定位分析;用RNAhybrid和miRanda 2种软件分别预测GALNTL5对应的miRNA并取交集,同时检测候选miRNA在附睾尾中的表达规律。[结果]GALNTL5 mRNA和蛋白在附睾体、尾中表现为性成熟后(9 M和24 M)显著高于性成熟前(3 M)(P<0.05);GALNTL5 mRNA在附睾头中表现为24 M显著高于3 M和9 M(P<0.05),但3 M与9 M之间差异不显著(P>0.05)。除了GALNTL5蛋白在9 M与24 M附睾尾中差异显著外,其余均差异不显著(P>0.05);GALNTL5蛋白在附睾头、体中的表达规律一致;GALNTL5定位于附睾主细胞、基细胞及精子中。预测获得11个候选miRNA,按评分高低进行排序,选取miR-487a-5p、miR-485-5p、miR-329b-5p和miR-27a这4个miRNA进行验证,发现miR-487a-5p表达水平表现为性成熟后(9 M和24 M)显著高于性成熟前(3 M)(P<0.05),而miR-485-5p和miR-27a呈现相反趋势。[结论]GALNTL5在精子成熟过程中扮演着重要的角色;miR-485-5p和miR-27a可能与GALNTL5存在靶向关系。

过表达Kdm4d对山羊孤雌胚胎基因组激活期Xist表达的影响

[目的]本试验旨在探究过表达赖氨酸特异去甲基化酶4D(Kdm4d)对山羊孤雌胚胎基因组激活期(8细胞期)Xist表达的影响。[方法]通过构建Kdm4d-IRES-EGFP重组质粒,体外转录Kdm4d mRNA,再利用显微注射、免疫荧光和亚硫酸氢盐测序等方法,分析过表达Kdm4d对山羊孤雌胚胎基因组激活期(8细胞期)Xist表达的影响。[结果]与对照组相比,组蛋白H3K9甲基化(H3K9me3)水平在2~8细胞期和囊胚期过表达Kdm4d的山羊孤雌胚胎中均显著降低,过表达Kdm4d山羊的4、8细胞期胚胎和囊胚的发育潜能无显著变化;Xist表达水平在过表达Kdm4d的山羊8细胞期孤雌胚胎中显著升高,但Xist启动子仍维持高甲基化,与对照组相比无显著变化。[结论]Kdm4d能有效移除孤雌胚胎中H3K9me3修饰,促进Xist表达,但不影响Xist启动子DNA甲基化水平和山羊孤雌胚胎发育潜能。本研究为深入理解Kdm4d调控山羊早期胚胎X染色体失活的机制奠定了基础。

基于CRISPR/Cas9系统构建绵羊VASA基因敲入载体及验证

本研究旨在探索VASA基因在绵羊睾丸发育中的表达变化,并通过构建VASA基因敲入载体,为下一步进行绵羊生殖细胞体外诱导分化研究提供基础。采集性成熟前后即3月龄(3-month-old,3M)和9月龄(9-month-old,9M)绵羊睾丸组织,利用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)和Western blotting技术分析VASA基因的差异表达,并利用免疫组织化学技术对VASA基因的表达定位进行分析。设计靶向VASA基因的向导RNA(guide RNA,gRNA),并构建同源重组载体,进行质粒转染绵羊耳成纤维细胞。结合CRISPR/dCas9技术对VASA基因进行激活,进一步验证载体效率。结果表明,VASA基因随着绵羊睾丸发育,表达水平极显著增加(P<0.01),且主要定位在精母细胞和圆形精子细胞中。利用CRISPR/Cas9系统构建了VASA基因敲入载体,联合pEGFP-PGKpuro-VASA载体转染耳成纤维细胞,CRISPR/dCas9系统激活后,耳成纤维细胞成功表达VASA基因。结果提示,VASA基因在绵羊睾丸发育和精子发生中发挥潜在功能,且通过CRISPR/Cas9系统可在体外构建VASA基因敲入载体,为下一步探究VASA基因对绵羊雄性生殖细胞的发育和分化提供有效的研究手段。