小婴儿肺炎患者沙眼衣原体培养的临床探讨

目的 了解小婴儿肺炎患者沙眼衣原体感染情况及对应的临床症状。方法 用鼻咽拭子采集 2 2 6例标本 ,同时用此采集法与鼻咽抽吸物采集法同时采集 6 3名患儿标本 ,用细胞培养法。结果 除去污染酶菌 35例小婴儿鼻咽拭子细胞培养沙眼衣原体 2 0 .9% (4 0 / 191)阳性。鼻咽拭子与鼻咽部抽吸物 6 3例 ,培养阳性分别的 11例与 10例 ,前者更适宜于临床应用。回顾并总结了小婴儿沙眼衣原体肺炎常见的特征性症状体征。结论 儿科医师应对沙眼衣原体引起的小婴儿肺炎要给予的足够重视。

细胞培养法应用聚乙二醇提高沙眼衣原体检测灵敏度初探

目的 探讨聚乙二醇 (PEG)提高沙眼衣原体 (CT)细胞培养灵敏度的方法。方法 使用含有PEG的生长培养基增殖CT标准株 ,用碘染色法检测CT。并对 10 0例新生儿肺炎鼻咽部标本CT进行检测。结果 用含 7%PEG的生长培养基培养增殖的CT是不含PEG生长培养基的 1 5～ 2 5倍。用于临床检测新生儿肺炎鼻咽部标本 ,包涵体数目明显增多。结论 在CT细胞培养中应用PEG ,可提高检测CT的灵敏度。含 7%PEG的生长培养基最适合增殖CT。

悬滴三步法体外诱导小鼠胚胎干细胞向心肌样细胞的分化

背景:研究胚胎干细胞分化为心肌细胞的条件和技术,进一步提高诱导分化率、细胞纯度,具有重要的理论和临床应用意义。目的:建立体外诱导胚胎干细胞分化为心肌细胞模型,为体外研究心肌细胞发育提供合适的实验方法。方法:采用悬滴-悬浮-贴壁三步法(悬滴三步法)对未分化的胚胎干细胞进行体外诱导分化培养,并按诱导剂的不同分为6组,Ⅰ组:丹参+5-氮杂胞苷;Ⅱ组:丹参+维甲酸;Ⅲ组:5-氮杂胞苷;Ⅳ组:丹参;Ⅴ组:维甲酸;Ⅵ组:阴性对照。诱导剂加入后9d,免疫细胞化学方法检测拟胚体α-actinin、myosin、α-actin的表达。结果与结论:诱导剂加入后第2天,倒置显微镜下见拟胚体自发性收缩,每个拟胚体可有1个或多个收缩中心。免疫细胞化学示心肌特异性结构蛋白α-actinin、myosin、α-actin均成阳性表达。Ⅰ组心肌细胞的分化率最高,与Ⅱ、Ⅵ组心肌细胞分化率比较差异有非常显著性意义(P<0.01),与Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组比较差异有显著性意义(P<0.05)。结果显示悬滴三步法联合中药丹参与5-氮杂胞苷为诱导剂,可提高体外胚胎干细胞分化为心肌细胞的分化率。

氨溴索对环丙沙星透过铜绿假单胞菌生物膜的影响

目的研究氨溴索对环丙沙星透过铜绿假单胞菌生物膜的影响。方法孔径为0.22μm的医用微孔滤膜建立铜绿假单胞菌生物膜的体外模型;用高效液相色谱(HPLC)方法测定环丙沙星透过生物膜的量,并测定在2和0.75mg/ml氨溴索作用后环丙沙星透过细菌生物膜的量。结果经过7d的连续培养后,铜绿假单胞菌可在微孔滤膜上形成均匀致密的生物膜。环丙沙星可缓慢透过细菌生物膜,8h左右达到平衡;2和0.75mg/ml氨溴索作用后可以明显增加环丙沙星8h内透过生物膜的量。结论以医用微孔滤膜为载体可建立铜绿假单胞菌生物被膜体外模型;氨溴索可以显著地促进环丙沙星对细菌生物膜的透过。

ESBLs耐药菌株分子流行病学调查

目的 :为了研究超广谱 β-内酰胺酶 (extendspectrum β-lactamase ,ESBLs)耐药菌株在儿科病房的分子流行情况 ,及时切断医院感染的传播途径 ,预防医院感染可能引起的暴发流行。方法 :对新生儿科、呼吸科、心脏内科、肾脏科、血液科以及儿童外科、ICU住院患儿进行痰、脐分泌物、脓、咽拭子培养 ,菌体药物敏感实验。分离筛选出ESBLs大肠埃希氏和肺炎克雷伯氏菌54株 ,进行质粒提取琼脂糖电泳分析。结果 :ESBLs在各科所占的百分率分别为46.3 %、12.9 %、5.6 %、12.9 %、5.6 %、11.1 %、5.6 %。在质粒谱的分析中发现有3种质粒谱带 ,新生儿科ESBLs菌所占比例较大 ,均有2株为相同质粒谱。结论

兔骨髓间充质干细胞心脏移植治疗扩张型心肌病的实验研究

目的探讨骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)心脏移植后对兔扩张型心肌病(dilated cardio-myopathy,DCM)心功能、心肌结构及心内膜单相动作电位(monophasic action potential durations,MAP)的影响。方法新西兰兔分为正常对照组(n=12),DCM实验组(n=13),DCM对照组(n=13),DCM模型通过静脉注射阿霉素诱导。DCM实验组移植骨髓MSCs,DCM对照组注射培养基,移植后4周采用超声心动图和MAP参数评价心功能和电生理的改变;并取移植区心肌组织行免疫荧光染色以观察移植细胞的增殖分化情况,另选部分心肌组织做HE染色和透射电镜查看心肌组织形态学改变。结果与正常组相比,DCM各组心功能明显受损、MAP时程延长、心肌细胞变性坏死,且实验组受损较对照组轻;移植的细胞有肌钙蛋白T(cardiac troponin T,cTnT)和缝隙连接蛋白43(connexin 43,Cx43)的表达。结论体内移植骨髓MSCs后在一定程度上可改善DCM心功能,使病损心肌组织病变减轻,并可能抑制心电紊乱的进一步发展。

丹参诱导骨髓间充质干细胞分化为神经样细胞的突触功能研究

目的探讨由丹参诱导骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)定向分化的神经细胞是否具有突触循环功能。方法采用优化诱导方案对4～5代状态好的MSCs进行反复多次诱导,终止诱导后分别进行免疫荧光细胞化学、细胞内钙离子流及突触功能检测。以50 mmol/L KCl作为诱发动作电位的刺激因子,采用激光共聚焦显微镜(LSCM)对Fluo-3/AM和SynaptoRed C-2荧光探针进行荧光激发,检测分化神经细胞在细胞外高钾刺激下细胞内钙流及细胞突触功能。结果4次诱导5 h后,神经样细胞伸出突起并交互成复杂网状;免疫荧光细胞化学显示4次诱导5 h后TUJ-1表达率为(96.7±2.8)%,突触小泡蛋白(synaptophysin)表达率为(96.2±2.1)%;LSCM显示4次诱导5 h后细胞在高钾刺激下细胞内钙流增加,细胞突触发生胞吞胞吐。结论丹参可高效快速诱导MSCs分化为神经细胞,此细胞具有正常的突触循环功能。

氨溴索对铜绿假单胞菌生物膜结构的影响

目的建立铜绿假单胞菌生物膜(biofilm,BF)模型,探讨氨溴索对粘液型铜绿假单胞菌成熟BF的结构影响。方法平板培养法培养铜绿假单胞菌7d,得到成熟BF,用扫描电镜(scanning electron microscope,SEM)观察氨溴索对BF形态结构的影响;激光共聚焦显微镜(confocal laser scanning microscopy,CLSM)结合BF图像结构分析软件(image struc-ture analyer,ISA)对BF结构参数分析;荧光显微镜定性观察氨溴索对BF内活菌的作用,并测定氨溴索单独作用以及与环丙沙星联用后BF内活菌的荧光强度。结果氨溴索作用后电镜观察可见BF被破坏,基质样物变稀疏,仅见少量散在细菌。ISA软件定量分析显示:2mg/ml氨溴索作用后,BF厚度、平均扩散距离(average diffusion distance,ADD)和结构熵(textual entropy,TE)均减少(P<0.05);区域孔率(areal porosity,AP)增加(P<0.05)。0.75mg/ml氨溴索干预后,有同样趋势,但效应不如高浓度明显。用荧光显微镜定性观察,当氨溴索浓度大于0.49mg/ml时,BF内活菌数减少。同时,氨溴索与环丙沙星存在协同作用(F=15.1,P<0.05),且随着氨溴索浓度升高,协同作用增强。结论氨溴索可影响铜绿假单胞菌成熟BF形态结构,从而增强抗生素的杀菌活性。

SYTO9／PI荧光探针标记的铜绿假单胞菌PAO1菌株生物被膜形成的动态观察

目的探讨铜绿假单胞菌细菌生物被膜(biofilm,BF)形成发展过程中空间立体结构变化。方法SYTO9/PI荧光探针标记PAO1菌株,体外建立6h、1d、3d及6d时间组铜绿假单胞菌PAO1菌株BF模型,激光共聚焦显微镜(confocal laser scanning microscopy,CLSM)摄取BF形成发展各阶段不同层面的图片堆,经图像结构分析软件(imagestructureanaly-zer,ISA)分析获得PAO1菌株BF相关空间结构参数定量化数据。结果①CLSM结合SYTO9/PI荧光探针标记,实现了对PAO1菌株BF动态形成过程的观察。②随着BF形成时间的延长,各层死菌比例逐渐增加,且死菌多分布于微菌落中心。③ISA软件定量化分析显示,随着BF发展,厚度显著增加,前3d增加程度显著大于后3d;区域孔率显著下降趋势;平均扩散距离呈逐渐增加趋势;结构熵呈显著上升趋势。结论利用ISA程序结合SYTO9/PI荧光探针可以表征PAO1菌株BF的空间结构特征和BF各层细菌的生存状态。

肿瘤微环境中间充质干细胞的相关生物学特性分析

目的探讨大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)在肿瘤微环境中是否获得肿瘤细胞的相关生物学特性而导致恶性转化。方法通过6孔板结合Transwell小室建立间充质干细胞和大鼠C6胶质瘤细胞的共培养体系,以共培养组为实验组,另设单独培养的间充质干细胞作为对照组。于相差显微镜下观察培养后两组细胞的形态学改变;采用流式细胞术(FCM)分析细胞周期变化;采用荧光定量PCR和免疫荧光法检测间充质干细胞mdm2、p53mRNA水平及共培养后两组细胞中p53突变蛋白和mdm2癌蛋白的表达。结果共培养后实验组细胞表现为胶质瘤细胞样形态。细胞周期检测结果显示共培养7d后,对照组G1期细胞占90.48%±6.62%,实验组占82.22%±2.74%,两组间差异无统计学意义(P>0.05);对照组S期细胞占4.66%±4.16%,实验组占7.35%±1.93%,两组间差异亦无统计学意义(P>0.05)。定量PCR及免疫荧光检测显示,实验组p53mRNA水平明显降低,为对照组的0.24倍(P<0.05);部分实验组细胞(24.8%)中表达突变型p53蛋白,而对照组无突变p53蛋白表达(P<0.05)。实验组mdm2mRNA及其蛋白的表达水平均明显高于对照组(P<0.05)。结论肿瘤微环境使大鼠骨髓间充质干细胞获得了肿瘤细胞的相关生物学特性。

肿瘤微环境中过表达的IL-6对大鼠间充质干细胞恶性转化的影响

目的分析肿瘤微环境中异常高表达的白介素6(IL-6)是否可导致间充质干细胞(MSCs)的恶性转化。方法 ELISA法检测肿瘤微环境与正常微环境中IL-6的表达差异。以肿瘤微环境中相应水平IL-6处理的MSCs为实验组,正常微环境中相应水平IL-6处理的MSCs作为正常对照组。采用免疫荧光法检测各组STAT3蛋白表达情况;通过细胞生长曲线观察各组MSCs增殖能力的变化;采用免疫荧光定量PCR和Western blotting检测p53和MDM2的蛋白及mRNA表达变化;通过裸鼠成瘤实验检测各组MSCs的体内成瘤能力。结果肿瘤微环境中IL-6的表达量为191.23±16.80pg/ml,明显高于正常微环境(0.82±0.12g/ml,P<0.01)。实验组90%±7%的MSCs表达STAT3蛋白,主要集中于细胞核,为激活状态,而对照组未检测到STAT3表达。细胞生长曲线显示,2个月后实验组MSCs生长接触抑制减弱。细胞培养2个月后,与对照组比较,实验组p53蛋白及mRNA表达明显降低(P<0.01),MDM2蛋白及mRNA表达明显升高(P<0.05)。实验组MSCs培养2个月后,接种裸鼠皮下可形成肿瘤,而对照组接种后未见肿瘤形成。结论肿瘤微环境中过表达的IL-6具有促进MSCs恶性转化的作用。

骨髓间充质干细胞与胶质瘤细胞非接触共培养后相关生物学特性分析

目的在体外通过大鼠胶质瘤C6细胞与大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)非接触共培养,以探明BMSCs是否受到肿瘤微环境的作用获得肿瘤细胞的相关生物学特性。方法通过6孔板结合Transwell小室建立BMSCs和C6胶质瘤细胞的共培养体系,以共培养组为实验组,设单独培养的BMSCs为对照组;相差显微镜下观察培养后2组细胞形态学的改变;核干细胞因子(nucleostemin,NS)检测细胞增殖力的变化;荧光定量PCR和Western blot检测细胞中mdm2、p53mRNA水平及其蛋白的变化;免疫荧光法检测神经胶质细胞特异的胶质纤维酸蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)在细胞中的定位及表达。结果共培养后实验组细胞呈现类似胶质瘤细胞样的形态,表达神经胶质细胞特异的GFAP蛋白;NS蛋白反映的细胞增殖能力未发生改变;共培养后实验组p53mRNA水平明显低于对照组(P<0.01),而p53蛋白的表达水平显著高于对照组[(1.63±0.31)vs(0.85±0.12),P<0.05];实验组mdm2mRNA及其蛋白的表达水平均明显高于对照组(P<0.05)。结论肿瘤微环境可能会使大鼠骨髓间充质干细胞获得肿瘤细胞的相关生物学特性。

纳米银离子对铜绿假单胞菌生物被膜的细菌死亡率的影响

目的探讨纳米银离子对细菌生物被膜(biofilm,BF)的细菌死亡率的影响。方法采用摇床法,以纳米银离子含量不同的乙烯-醋酸乙烯酯(Ethylene-Vinyl acetate,EVA)塑料为细菌粘附载体,模拟体内铜绿假单胞菌(P.aerugi-nosa,PA)BF形成的微环境,建立体外BF模型;将培养3 d的空白标本分别在扫描电子显微镜(SEM)下及用FITC-ConA染色后荧光显微镜下观察不含纳米银离子EVA中BF的形成情况;将生长0.5、1、2、3、5 d的BF模型行SYTO9/PI染色,激光共聚焦扫描电镜(CLSM)下摄取不同层面的图像,然后采用Image Pro Plus 6.0分析软件分析不同干预条件下BF的细菌的死亡率。结果运用SEM及荧光显微镜的方法,在以不含纳米银离子EVA塑料的细菌粘附载体上培养3 d的标本中均观察到流线状的BF形成;纳米银离子含量、作用时间对BF的细菌死亡率均有明显影响(F值分别为84.62,85.67,P<0.01);不同时间点含有纳米银离子材料的BF细菌死亡率均显著高于空白对照组(P<0.05),但纳米银离子含量不同的2种材料上BF的细菌死亡率无明显影响(P>0.05);纳米银离子含量不同的(0、0.05%、0.1%)材料上的BF,其第1、2、3天细菌死亡率均分别显著高于第0.5、5天的细菌死亡率(P<0.05);含纳米银离子0.1%的材料上BF在作用的第2天其细菌死亡率最高[(88.53±1.88)%]。结论运用摇床法成功建立了体外BF模型,纳米银离子对BF内的细菌有明显杀灭作用。

大鼠骨髓间充质干细胞适宜分离和培养条件的研究

目的 :寻求适宜有效的大鼠骨髓间充质干细胞 (mensechymalstemcell,MSCs)体外分离、纯化和培养的条件 ,为MSCs进一步的实验研究打下基础。方法 :分别用贴壁筛选法和密度梯度离心法来分离和纯化MSCs ,并用不同的接种密度、不同的血清浓度和不同的培养基检测细胞的生长情况 ,绘制出细胞的生长曲线 ;流式细胞仪检测MSCs生长周期。结果 :细胞贴壁呈纤维状生长 ,以 2× 10 9的浓度接种 ,在含 10 %胎牛血清的DMEM /F12培养基中 ,37℃、5 %CO2 细胞培养箱中 ,细胞生长状况良好 ;细胞在培养的最初几天处于生长的潜伏期 ,而后呈指数级生长 ,随着时间的延伸 ,细胞的生长速度减慢 ;而流式细胞仪检测示细胞大多处于G0 G1期。结论 :在适宜的培养条件下 ,MSCs在体外培养的过程中生长状态良好 ,增殖速度快 ,为进一步的研究打下了基础。

鼠骨髓间充质干细胞在缺氧缺血性脑病新生鼠脑内的分布及分化

目的 探讨鼠骨髓间充质干细胞 (MSCs)在缺氧缺血性脑病新生鼠脑内的分布及分化。方法 采用全骨髓贴壁筛选法分离培养鼠骨髓间充质干细胞 ,移植前加入 5 溴 2 脱氧尿嘧啶核苷 (BrdU)连续标记 72h。采用Rice法制备新生鼠缺氧缺血性脑病模型 ,2 4h后经前囟旁缓慢注射 4× 10 6 个MSCs入缺氧缺血性脑性脑病新生鼠右侧脑内 ,4周后进行免疫组化检测MSCs的分布并鉴定神经元巢蛋白 (Nestin)、神经元特异性烯醇化酶 (NSE)、胶质纤维酸性蛋白 (GFAP)的表达。结果 Rice法可制备新生鼠单侧脑损伤为主的缺氧缺血性脑病模型 ,MSCs移植入脑后主要分布在患侧大脑 ,呈弥散性分布于皮层、海马等部位 ,细胞计数左侧为 (2 781± 2 5 4) ,右侧为 (4 70 8± 2 81) ,双侧比较t=18 70 ,P <0 0 0 1,并神经性分化 ,左、右侧Nestin分化率为 (1 5 6± 0 47) % ,(71± 0 42 ) 1% (t =1 741,P >0 0 5 ) ;NSE为 (3 79± 0 95 ) % ,(5 69±1 48) % (t =3 40 4,P <0 0 5 ) ;GFAP为 (2 0 6± 0 89) % ,(2 47± 1 75 ) % (t=0 85 5 ,P >0 0 5 )。结论 MSCs颅内直接移植后主要分布在患侧大脑 ,MSCs移植后 2 8d可分化为神经干细胞、成熟神经元和星型胶质细胞。

不同浓度菲立磁对大鼠间充质干细胞标记效率和细胞活力的影响

目的探讨不同浓度菲立磁标记大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的磁标记效率及对细胞生长活力的影响,寻找最佳标记浓度。材料与方法菲立磁与多聚左旋赖氨酸(PLL)混合制备菲立磁-PLL复合物。将不同浓度的菲立磁-PLL复合物与培养基混合(铁的终浓度分别为150μg/ml、100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、10μg/ml和5μg/ml),加入MSCs孵育过夜。分别于标记后1天、1周、2周、3周、4周行铁染色、铁含量测定及细胞活力检测。结果菲立磁-PLL标记组细胞铁含量显著高于单纯菲立磁标记组(P<0.05),25μg/ml浓度组细胞铁含量显著高于10μg/ml及其以下浓度组(P<0.05),但与50μg/ml及其以上浓度组差异无统计学意义(P>0.05)。台盼蓝排除试验显示,100μg/ml及其以下浓度组细胞活力与对照组之间差异无统计学意义(P>0.05)。结论以25μg/ml铁浓度标记干细胞不仅标记效率高,而且对细胞活力无明显影响,为菲立磁标记MSCs的最佳浓度。

绿色荧光蛋白标记铜绿假单胞菌生物膜形成的动态观察及结构定量分析

目的探讨铜绿假单胞菌细菌生物膜(biofilm,BF)形成发展过程中空间立体结构变化,以及BF形成过程中与其生物学行为之间的相互联系。方法体外建立6h和1、3及6d等4个时间组铜绿假单胞菌PAO1菌株BF模型,通过绿色荧光蛋白(greenfluorescence protein,GFP)标记,结合激光共聚焦显微镜(confocal laser scanning microscopy,CLSM)摄取BF形成发展各阶段不同层面的图片堆,经图像结构分析软件(image structure analyer,ISA)分析获得PAO1菌株BF相关空间结构参数定量化数据。结果1CLSM结合GFP标记,实现了对PAO1菌株BF动态形成过程的观察;2ISA软件定量化分析显示,随着BF发展,厚度不断增加,前3d增加程度(19.6μm)明显大于后3d(6.1μm),区域孔率(areal porosity,AP)、平均扩散距离(average diffusion distance,ADD)和结构熵(textural entropy,TE)在BF形成的6h和6d分别为:0.98±0.01和0.92±0.02,呈现下降趋势;1.00±0.009和1.06±0.027,虽变化幅度不大,但亦呈现逐渐增加趋势;0.7±0.08和4.3±0.09,呈明显上升趋势。结论ISA程序可以表征PAO1菌株BF的空间结构特征,对细菌BF结构的定量化分析也有助于探索BF形成过程与其生物学行为之间的相互联系。

兔骨髓间充质干细胞体外分离培养及冻存研究

目的:寻求体外培养、冻存、复苏兔骨髓间充质干细胞(mensechymalstemcells,MSCs)的方法,为兔MSCs进一步的实验研究打下基础。方法:取新西兰白兔胫骨穿刺获取骨髓液,以贴壁筛选法分离、纯化、培养和扩增获得MSCs,并行液氮冻存,通过倒置显微镜观察其生物学表现。结果:MSCs为贴壁生长,形态为均匀成纤维细胞样,增殖能力强,传代及冻存后细胞仍然保持其生物学特性。结论:MSCs可采取贴壁筛选法进行较好的纯化和扩增,并可长期保存于液氮中,在一定的条件下可复苏存活。

小鼠Islet-1基因慢病毒表达载体的构建及其诱导C_3H_(10)T1/2细胞向心肌样细胞特异性分化

目的研究Islet-1对干细胞分化的影响。方法用PCR钓取目的基因,将目的基因与pLenO-WPI载体连接,选取阳性质粒,与辅助质粒共同感染293T细胞生产出慢病毒载体。感染C3H10T1/2细胞,实时荧光定量PCR及Western blot检测Islet-1和心肌、肝脏、骨骼及神经各系统相关标志物的表达,免疫荧光检测心肌肌钙蛋白T(cTnT)表达部位。结果 PCR及测序显示目的片段正确插入,实验组有Islet-1表达;心肌早期发育相关基因GATA-4、MEF2C、NKx2.5在检测到荧光蛋白1周后升高,2周到达高峰,3周后可检测到心肌特异性蛋白cTnT(0.582±0.0576),其时序性表达呈随时间增强趋势;cTnT表达于胞质;肝脏系统特异性标志AFP及ALB、骨骼系统特异性标志BGP及BALP、神经系统特异性标志Nestin及GFAP均未表达。结论 Islet-1具有特异性促进干细胞向心肌样细胞分化的作用。

质粒缺口-连接酶链反应-酶联免疫吸附法检测沙眼衣原体

目的:建立高度灵敏特异的质粒缺口-连接酶链反应-酶联免疫吸附法(Gap-LCR-ELISA)检测沙眼衣原体(Chlamy-diatrachomatisCT)。方法:根据CT共有隐蔽性质粒设计并标记4条寡核苷酸探针,对6型CT标准株和鹦鹉热衣原体及其他常见泌尿生殖道病原菌行Gap-LCR-ELISA。结果:质粒Gap-LCR-ELISA可检测出6型CT,并与其他病原体无交叉反应,其最低检测限为2.5个原体(elementarybodiesEB)比PCR敏感10倍。结论:质粒Gap-LCR-ELISA对检测CT感染具有极高的灵敏度和特异度,适宜于我国进行大规模CT流行病学调查。