反基因策略及其靶序列的选择

反基因策略及其靶序列的选择刘定燮，王昌才，黄建生（第一军医大学分子生物学研究所，广州５１０５１５）关键词三链ＤＮＡ，反基因策略合成的脱氧寡核苷酸在一定条件下可缠绕于ＤＮＡ双螺旋的大沟内并以氢键与其相互作用形成三链ＤＮＡ结构。一般把这类能形成三链结构的...

单质粒模式诱导表达载体系统的建立

在Invitrogen公司T Rex诱导表达系统的基础上,将目的基因与调控蛋白基因克隆于同一载体上,并在CV1细胞中观察了四环素对该单质粒模式载体报告基因表达的诱导效应.载体在瞬时转染CV1细胞并以四环素诱导 2 4h后目的基因的表达水平提高了 8 9倍。

三链DNA的形成抑制DNA结合蛋白与启动子的结合

电泳迁移分析方法及ＤＮａｓｅⅠ足迹实验表明２１ｎｔ脱氧寡核苷酸Ｇ３ＴＧ２ＴＧＴ２Ｇ５ＴＧ２ＴＧＴ（ＣＰ１）与乙肝病毒（ＨＢＶ）核心启动子（Ｃｐ）片段之间三链ＤＮＡ的形成有较高的特异性及稳定性．凝胶滞留实验显示，在大鼠肝细胞核提取物体外转录系统中，ＣＰ１可特异地抑制ＤＮＡ结合蛋白与Ｃｐ片段的结合，而不能与Ｃｐ结合形成三链ＤＮＡ的脱氧寡核苷酸ＣＰ３（ＴＧＴＧ２ＴＧ５Ｔ２ＧＴＧ２ＴＧ３）对蛋白与Ｃｐ的结合并无抑制作用．这些结果表明，三链ＤＮＡ的形成有可能抑制ＨＢＶＤＮＡ的转录．

哺乳动物细胞表达系统及其研究进展

从表达载体、宿主细胞、表达系统的类型及选择等四个方面对哺乳动物细胞系统进行了综述。对相关的研究进展,如高效启动子的发现和改构、新型细胞株的建立及诱导表达调控系统亦作了简要介绍。通过这些阐述,期望能建立一个简洁而清晰的有关该表达系统的框架,对在实验中决定选取何种载体、细胞株或何种表达方式时能够有所提示。

用部分补平法克隆乙型肝炎病毒preS/S基因

目的探讨利用Ｋｌｅｎｏｗ大片段对ＤＮＡ末端作部分补平而使非匹配粘端形成匹配粘端的可行性。方法用 ＢａｍＨＩ、ＸｂａｌＩ消解载体 ｐｃＤＮＡ３，用 ＢｇｌＨ、Ｈｉｎｄ Ⅲ从含乙型肝炎病毒全基因组质粒中切取 ＨＢＶｐｒｅＳ／Ｓ基因片段。 ｐｃＤＮＡ３的 ＸｂａｌＩ及 ｐｒｅＳ／Ｓ基因的 Ｈｉｎｄ Ⅲ切口端经 Ｋｌｅｎｏｗ大片段作部分补平后形成二碱基的互补粘端。连接修饰 后的ｐｒｅＳ／Ｓ基因片段与ｐｃＤＮＡ３并转化后筛选阳性克隆。结果限制性内切酶分析显示ｐｒｅＳ／Ｓ基因被定向克隆于载 体ｐｃＤＮＡ３的预定位点。结论部分补平法是连接非匹配ＤＮＡ粘性末端的较好选择。

Klenow大片段的聚合酶及核酸酶活性在重组质粒构建中的巧用

目的 探讨应用大肠杆菌Klenow大片段同时补平及切平DNA 3'凹端或3'凸端的可行性。方法 以构建乙型肝水（乙肝）病毒S基因的真核表达载体为例，用Kpn I及Xhol I消解含乙肝病毒前S/S基因的质粒，切除质粒中的前S区基因序列。通过Klenow大片段的核酸外切酶的活性切平质粒Kpn I切口的3'凸端，再利用其聚合酶活性补平Xhol I的3'凹端。处理后的质粒经连接酶作用而自身环化后，转化并筛选阳性克隆。结果 重组质粒获得了限制性内切酶分析的证实；对重组质粒的序列测定表明，Kpn I及Xhol I酶切端经Klenow大片段切(补)平并重新连接后其接续口端序列与预期一致。结论 对质粒作内部改建中，质粒两端分别为3'凸端及3'凹端时，可以同时利用Klenow大片段的两种酶活性将DNA末端修饰为平端，以便于使质粒自身环化。

DNA的G-四联体螺旋结构

ＤＮＡ的Ｇ┐四联体螺旋结构刘定燮王昌才（第一军医大学分子生物学研究所，广州５１０５１５）关键词ＤＮＡＧ－四联体螺旋端粒是由独特的ＤＮＡ序列及相关蛋白质组成的线性真核染色体末端结构，它参与稳定染色体末端及其精确复制等过程。端粒ＤＮＡ一般由富含Ｇ的简单重...

乙型肝炎病毒C区蛋白在肝癌细胞株中的表达

用PCR法获得编码乙型肝炎病毒C区不同蛋白的基因,利用基因重组技术构建表达这些蛋白的真核表达载体,并在高分化肝癌细胞株HepG2中进行了稳定表达。

乙肝病毒核衣壳启动子内三链DNA的形成

用电泳迁移分析方法研究了２１ｎｔ脱氧寡核苷酸Ｇ３ＴＧ２ＴＧＴ２Ｇ５ＴＧ２ＴＧＴ（ＣＰ１）与１２９ｂｐ的乙肝病毒（ＨＢＶ）核衣壳启动子（Ｃｐ）片段内一位点结合形成的三链ＤＮＡ的特异性及稳定性．在克隆有ＨＢＶ基因组的质粒ｐＣＰ１０的酶切产物中，ＣＰ１仅与含Ｃｐ的１２９ｂｐ片段结合．在２０ｍｍｏｌ／ＬＭｇ２＋溶液中其解离常数（Ｋｄ）为１．４×１０－７ｍｏｌ／Ｌ．不同离子稳定三链ＤＮＡ的效果依次为ｓｐ４＋（精胺）＞Ｍｇ２＋＞Ｚｎ２＋＞Ｎａ＋＞Ｋ＋，离子之间存在相互竞争作用．比ＣＰ１多一误配碱基的脱氧寡核苷酸Ｇ２ＴＧ２ＴＧＴＧ３ＴＧ２ＴＧ２ＴＧ２Ｔ（ＣＰ２）在２０ｍｍｏｌ／ＬＭｇ２＋溶液中与Ｃｐ结合的Ｋｄ值约为ＣＰ１的１／７，而在６０ｍｍｏｌ／ＬＫ＋或５ｍｍｏｌ／ＬＺｎ２＋溶液中检测不到它与Ｃｐ的结合，这进一步显示了三链ＤＮＡ形成的特异性．细胞的生理离子浓度被认为是：Ｓｐ４＋１ｍｍｏｌ／Ｌ，Ｍｇ２＋１０ｍｍｏｌ／Ｌ，Ｋ＋１４０ｍｍｏｌ／Ｌ，因此，ＣＰ１在细胞内将能特异地与Ｃｐ结合并具有较好的稳定性．

头尾串联双拷贝HBVDNA重组体的构建

为构建含筛选基因并能在转染细胞内建立HBV复制状态的真核表达载体，利用BamHI与BglH粘端互补的特点，将经BamHI线性化的HBVDNA（adr亚型）克隆于表达新霉素基因的载体pcDNA3的BamHI与BglII位点间，获得含头尾串联双拷贝HBV基因组的重组质粒。

反基因策略——基因治疗的新方向

自1980年Cline用重组β珠蛋白基因治疗两名β地中海贫血患者以来,基因治疗在取得众多成就的同时也暴露出一些问题。安全方面的风险及转移基因表达的不稳定性使基因替代疗法还远达不到人们最初所预想的效果。基因原位修复虽是基因治疗最理想的途径,但目前在技术上还很难做到。相比之下,反义治疗在现阶段可能是较好的方向,因为反义核酸具有传统药物的使用方便和容易大量生产等优点。

乙型及丙型病毒性肝炎发病机制的新设想

近几年来的实验研究提示．肝细胞凋亡在肝炎的发病机制中起重要作用。表现在：（１）乙型及丙型肝炎病人肝组织中肝细胞凋亡的数量显著高于正常人：（２）乙型及丙型肝炎病人肝细胞Ｆａｓ的表达水平与炎症活动程度是相关。（３）小鼠实验模型中大量肝细胞的凋亡可引起重型肝炎，而抑制凋亡能减轻肝组织的损伤。（４）在细胞毒性Ｔ淋巴细胞引起的转基因小鼠的肝炎模型中，肝炎的发生先后经历了细胞凋亡、细胞坏死几个不同的阶段。本文将试图阐述我们对肝细胞凋亡与乙型及丙型肝炎发病机制间可能关系的认识。

细胞凋亡信号的基本转导通路

在诱导细胞凋亡过程中，许多细胞外刺激常共用一段相同的信号转导路径，可称之为凋亡的基本信号通路。ＴＮＦ受体家族如ＴＮＦ受体及Ｆａｓ受体在与相应的配体结合后，通过蛋白死亡区的相互作用，激活ＩＣＥ蛋白酶家族；活化的蛋白酶引起多种底物如核酸酶抑制剂、细胞骨架蛋白等的降解，导致细胞出现凋亡的生化及形态学改变。

SV40载体在COS7细胞中的复制及外源基因的表达

为评价SV4 0载体 COS7稳定表达系统的可能应用价值 ,将含人组织型纤溶酶原激活剂 (t PA)编码区的SV4 0载体pctPA转染COS7细胞 ,并以G4 18选择培养 2 8d ,得到稳定的抗性细胞库 .Southern印迹和溶圈法分别分析该细胞库在随后的细胞传代中细胞内附加体拷贝数及t PA表达水平的变化 .在经选择培养 2 8d的COS7细胞库中 ,质粒pctPA以染色体外附加体的形式存在 (30 0拷贝 细胞 ) ,t PA的表达水平为 1 1μg d(10 6细胞 ) .在随后 3个月的动态观察中 ,随着细胞传代 ,该COS7细胞库tPA的表达水平虽逐渐递减 ,但在第 1个月内可保持在 1μg d(10 6细胞 )以上 .基于SV4 0载体 COS7稳定表达系统无需筛选克隆 ,在稳定的抗性细胞库形成后的 1个月内可能保持目的基因的高水平表达 ,因而较适合于需同时制备多种重组蛋白的实验 .

应用T/A策略克隆乙肝病毒pC/C及C基因

以克隆乙型肝炎病毒 pC/C及C基因为例 ,报道了在DNA重组中 ,当目的基因与载体末端不匹配时可采取的一新方法 .用内切酶切取的基因片段为平端时 ,可在含dATP的反应体系中 ,用Taq酶的末端转移酶活性在其 3′末端加上单个碱基 (dA)的突出尾 ;基因片段为 3′凹端时 ,可在含 4种dNTP的体系中 ,利用Taq酶的聚合酶活性先将其末端补平 ,再经末端转移酶活性在其 3′末端加dA尾 ;末端经此修饰的基因片段可亚克隆至T载体中 。

乙型肝炎病毒S区蛋白肝癌细胞株的稳定表达

构建了乙肝病毒S区不同蛋白的重组真核表达质粒pcLS2、pcLS4,并转染肝癌细胞株HepG2。转染细胞经新霉素筛选后,获得稳定表达S区不同蛋白的细胞株。Westernblotting可分别检测到相对分子质量为39000的大蛋白及24000的主蛋白在pcLS2、pcLS4稳定转染的细胞中表达。免疫组化实验显示这些蛋白均主要呈细胞质分布。

三链DNA的形成抑制转录因子与乙肝病毒核衣壳启动子的结合

合成的寡核苷酸可缠绕于DNA双螺旋大沟内并以氢键与其相互作用形成三链DNA结构,这类寡核苷酸常简称为TFO(triplex-form-ing oligonucleotide)。通过TFO与靶基因结合形成局部的三链结构来抑制基因转录的技术被称为反基因策略(antigene strategy)。我们选择乙肝病毒(HBV)核衣壳启动子(Cp)内一近似同聚嘌呤·同聚嘧啶序列(1734～1754,ayw亚型,以EcoR Ⅰ切点为+1)为靶序列。

反基因策略: 基因治疗的新方向

合成的富含嘌呤或嘧啶的脱氧寡核苷酸可与双链ＤＮＡ内特定的同聚嘌呤、同聚嘧啶序列结合形成稳定的三螺旋结构（三链ＤＮＡ）。已在体外及体内证实了在靶基因内形成的局部三链ＤＮＡ可抑制其转录，这给肿瘤和病毒感染性疾病的治疗提示了新的方向，人们称之为反基因策略。然而，三链ＤＮＡ的稳定性不够理想和靶序列的选择范围较窄等问题的存在，在一定程度上限制了反基因策略的应用。

肝细胞核因子3参与乙肝病毒基因的转录调控

肝细胞核因子３参与乙肝病毒基因的转录调控刘定燮，王昌才（广州第一军医大学分子生物学研究所，广州５１０５１５）关键词肝细胞核因子３，乙肝病毒，转录调控Ｃｏｓｔａ等在研究肝细胞甲状腺素和维生素Ａ载体蛋白（ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ）基因的调控时发现，其转...

三链DNA稳定性的影响因素

介绍了碱基组成、碱基修饰或替代、DNA骨架的修饰、DNA配体的结合及反应体系中的盐离子和pH值等因素对三链DNA稳定性的影响。对三链DNA稳定性研究中应注意的几个问题也作了讨论。