抗凝溶栓重组葡激酶-水蛭素融合蛋白的构建与表达

目的:探讨抗凝溶栓重组葡激酶-水蛭素融合蛋白的构建效果与抗凝溶栓活性表达情况。方法:在间接实验中,选择p BV-重组葡激酶-水蛭素融合蛋白质质粒进行酵母大量表达,再进行两级纯化分析;去纯化的单位进行抗凝溶栓的检测。结果:工程菌酵母发酵培养诱导1 h后就可以检测到重组葡激酶-水蛭素融合蛋白表达,表达量随发酵时间的增加而递增。两级纯化的重复性非常好,纯度经RP-HPLC测定在98%以上。重组葡激酶-水蛭素融合蛋白的溶栓活性明显高于水蛭素与葡激酶的单纯溶栓活性(P<0.05)。重组葡激酶-水蛭素融合蛋白具有更强的纤溶酶原激活活性,明显高于水蛭素与葡激酶的单纯纤溶酶原激活活性(P<0.05)。结论:重组葡激酶-水蛭素融合蛋白生产工艺具有很好的诱导与纯化效果,重组葡激酶-水蛭素融合蛋白能发挥较好的抗凝与溶栓作用。

重组葡激酶-水蛭素融合蛋白的构建表达

背景:重组融合蛋白是根据凝血酶识别顺序将葡激酶与水蛭素串联而成的蛋白,具有双重功能,分子质量为23 ku,可在工程菌高密度发酵状态下获得高效表达。目的:通过对工程菌进行高密度发酵,构建重组葡激酶-水蛭素融合蛋白纯化工艺,并探讨其构建可行性及表达价值。方法:对工程菌进行高密度培养,并诱导表达重组葡激酶-水蛭素融合蛋白,对菌体进行离心收取,多次冻融后通过超滤、两部阴离子交换层析方法收集上清液,对重组葡激酶-水蛭素融合蛋白进行分离纯化,观察其纤溶比活性及在菌体中的高效表达价值。结果与结论:发酵培养工程菌,并在第17小时时予以诱导。结果发现,诱导0.5 h时,便能观察到重组葡激酶-水蛭素融合蛋白表达,且发酵时间越长重组葡激酶-水蛭素融合蛋白表达量相应越大;至发酵20 h时,表达达到顶峰。菌体干质量为32.20 g/L,目的蛋白表达量约为1.48 g/L。经过纯化处理后,重组葡激酶-水蛭素融合蛋白纯度高达98%,纤溶比活性约为2.6×104 IU/mg,回收活性的概率为56%。实验通过构建重组葡激酶-水蛭素融合蛋白纯化工艺,并分析其表达价值,提示该纯化工艺较为便捷,耗时较短,且能重复使用,可用于大规模生产。