青杄PwUSP1基因特征及对干旱和盐胁迫的响应

【目的】USPs蛋白(universal stress proteins)是一类胁迫相关类蛋白,被广泛报道参与了植物应对非生物胁迫的过程。本研究通过对青杄中PwUSP1基因进行功能分析及验证,探索PwUSP1在植物应对盐和干旱胁迫时的作用,从而为未来通过转基因工程提高青杄对非生物胁迫的耐受性提供候选基因。【方法】通过瞬时转化烟草叶片实验揭示PwUSP1在细胞中的定位;利用酵母双杂实验鉴定PwUSP1自身能否形成同源二聚体;通过农杆菌侵染法转化野生型拟南芥(WT),获得纯合的PwUSP1过表达株系。通过测定干旱和盐胁迫下过表达株系(L1、L7)及野生型(WT)和空载体(VC)株系的存活率、失水率,来分析比较不同株系对于干旱和盐胁迫的耐受能力;通过二氨基联苯胺(DAB)和氯化硝基四氮锉蓝(NBT)染色,测定超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)以及丙二醛(MDA)的含量,研究PwUSP1发挥作用的生理机制。【结果】烟草亚细胞定位实验表明,PwUSP1定位于细胞核、细胞质和细胞膜中。酵母双杂结果显示PwUSP1蛋白自身能够形成同源二聚体。利用qRT-PCR检测转基因拟南芥,成功获得两个稳定纯合的株系(L1、L7)进行进一步分析。在盐和干旱胁迫下,相对于WT和VC,过表达PwUSP1能够显著提高植物对盐和干旱的耐受能力,表现出更高的存活率和更低的失水率,且显著降低了植株中过氧化氢、超氧阴离子的累积,提高了SOD、POD和CAT活性,抑制了MDA的积累。【结论】青杄PwUSP1定位于细胞核、细胞质和细胞膜中且自身能够形成同源二聚体,在干旱和盐胁迫条件下,PwUSP1通过增强植物的ROS清除能力及抑制膜脂氧化损伤来提高植物对非生物胁迫的耐受性。

青杄转录因子基因PwNF-YB8的克隆与功能分析

【目的】NUCLEAR FACTOR Y(NF-Y)转录因子在真核生物中广泛存在,通常由NF-YA、NF-YB和NFYC 3个亚基形成异源三聚体,来结合下游靶基因启动子中的CCAAT顺式作用元件,进而调控植物的生长发育进程,并参与植物非生物逆境胁迫过程。本研究对青杄中PwNF-YB8基因的表达特性及功能进行分析,揭示其参与的生理过程及对非生物逆境胁迫的响应。【方法】根据实验室前期EST测序及RNA-seq转录组数据分析结果获得青杄NF-Ys家族基因序列,克隆得到PwNF-YB8的cDNA序列,并对其编码蛋白进行序列特征和进化树分析。采用qRT-PCR分析PwNF-YB8在不同组织和花粉萌发过程中的表达特性,以及高温、盐胁迫、甘露醇、ABA处理后的表达变化。亚细胞定位揭示PwNF-YB8在细胞中发挥功能的场所。通过酵母双杂交试验、双分子荧光互补试验分别检测PwNF-YB8的转录激活活性以及与PwHAP5的互作情况。农杆菌介导花序侵染法转化野生型拟南芥(WT),获得纯合的PwNF-YB8过表达株系。利用CRISPR/Cas 9技术获得其同源基因AtNF-YB8的突变体。甘露醇和盐处理后测定野生型(WT)、空载体(VC)、突变体株系(nfyb8-cas9#1/12)和过表达株系(L4、L5)的萌发率、幼苗根长,分析比较不同株系对于渗透胁迫和盐胁迫的耐受能力。【结果】PwNF-YB8基因的开放阅读框为489 bp,编码162个氨基酸,具有典型的NF-YB保守结构域,并且与白云杉同源基因具有较近的亲缘关系。SqRT-PCR和qRT-PCR结果表明在青杄的根、茎、针叶和花粉中均能检测到PwNF-YB8的表达,其在花粉中的表达量最高。亚细胞定位试验结果显示,PwNF-YB8定位于细胞核、细胞质中。酵母自激活试验显示PwNF-YB8自身无转录激活活性。进一步对青杄幼苗进行高温(42℃)、盐胁迫、甘露醇和脱落酸处理后发现,PwNF-YB8对干旱和盐2种非生物逆境处理明显响应。PwNF-YB8参与了花粉萌发过程,在花粉萌发36 h时表达量最高。酵母双杂交和双分子荧光互补试验证明PwNF-YB8能够与NF-YC亚基中的PwHAP5互作,可能共同参与花粉管发育调控。甘露醇或盐处理下,异源过表达PwNF-YB8基因的拟南芥种子萌发率与野生型差异不显著,但其根长表现出一定的生长优势。【结论】青杄PwNF-YB8能够与PwHAP5互作,参与花粉萌发和花粉管生长过程,并在干旱、盐胁迫响应中发挥作用。

基质及生根粉处理对‘山农选4号’ 刺槐扦插生根的影响

以优良无性系‘山农选4号’刺槐为对象,研究不同基质和不同ABT生根粉浓度处理对刺槐扦插成活效果的影响,结果表明:采用珍珠岩和蛭石组合、泥炭和珍珠岩组合并用100 mg/kg的ABT生根粉溶液浸泡可显著促进刺槐扦插生根。