茅苍术AlPMK1、AlPMK2基因的克隆和表达分析

目的从茅苍术中克隆萜类化合物生物合成途径中的甲羟戊酸-5-磷酸激酶(PMK)基因,并对其进行序列分析、原核表达及基因表达分析。方法基于茅苍术转录组数据,采用RT-qPCR法克隆获得茅苍术的2条甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因的全长序列,命名为AlPMK1、AlPMK2,使用生物信息学软件预测AlPMK1,AlPMK2编码蛋白的特征;利用MEGA 6.06软件构建系统进化树;构建原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达;运用RT-qPCR检测该基因在不同产地茅苍术中的相对表达及经不同时间茉莉酸甲酯诱导后的表达情况。结果AlPMK1、AlPMK2基因的ORF长度分别为1512、1590 bp,分别编码503 aa、529 aa。2个基因的二级结构中α螺旋和无规则卷曲占比最高,均属不稳定的酸性蛋白;结构功能域分析证明AlPMK1、AlPMK2分别在4~490 aa,40~527 aa处包含甲羟戊酸激酶的保守结构域;跨膜结构域分析预测,两者均为膜外蛋白;SDS-PAGE结果显示,分别在55、58 kDa处有清晰的目的蛋白表达。基因表达结果显示,在不同时间的茉莉酸甲酯诱导下AlPMK1、AlPMK2的基因表达分别在48、24 h达到最高值,且均在3 h表达最低。不同产地的茅苍术AlPMK1、AlPMK2基因具有组织特异性,两者均在岳西茅苍术的叶中表达量最高。结论本研究首次克隆2条茅苍术AlPMK1、AlPMK2基因,并对其进行表达分析,为进一步探究茅苍术萜类生物合成途径奠定基础。

茅苍术转录因子AlWRKY65的克隆与功能初探

WRKY转录因子是植物特有的一类转录因子,在植物多种生理过程中发挥重要的作用。本研究以茅苍术转录组数据为依据,对茅苍术AlWRKY基因与AlTPS基因的FPKM值进行相关性分析,结合分析结果筛选出与AlTPS1、AlTPS6基因表达量具有显著正相关性且FPKM值相对较高的候选基因AlWRKY65,对该候选基因进行克隆,获得AlWRKY65基因的开放阅读框(ORF),分析其编码蛋白的相关信息并进行基因表达研究。研究结果表明,AlWRKY65包含一个681bp的开放阅读框,编码226个氨基酸。AlWRKY65基因编码的氨基酸序列与向日葵HaWRKY65、莴苣LsWRKY65等植物基因编码的氨基酸序列具有较高同源性;该蛋白具有1个WRKYGQK保守结构域,属于WRKY基因家族的第IIe组;系统进化树分析显示,茅苍术AlWRKY65与洋蓟CcWRKY65蛋白亲缘关系较近;运用实时荧光定量PCR检测AlWRKY65基因在2个产地不同组织中的表达水平,结果表明,不同产地的茅苍术AlWRKY65基因具有组织表达差异性,均在叶片中表达量较高;在茉莉酸甲酯(MeJA)诱导处理48 h内,AlWRKY65基因的表达量下调;亚细胞定位和转录自激活活性分析显示,AlWRKY65定位于细胞核,不具有自激活活性。这些结果为进一步研究AlWRKY65在茅苍术中的生物学功能提供参考。