新生大鼠肝细胞分离及体外培养方法

背景:新生大鼠肝细胞是中度分化细胞,兼具肝祖细胞和成熟肝细胞的特性和功能,是研究肝细胞特性的理想细胞来源。目的:探讨新生大鼠肝细胞分离及体外培养方法。设计、时间及地点:细胞学体外实验,于2008-03/08在解放军总医院普通外科研究所完成。材料:SD新生大鼠,雌雄不限,3月龄。方法:采用组织块-胰酶冷消化法和多步低速离心获取新生大鼠肝细胞,给予含体积分数10%胎牛血清的HepatoZYME-SFM培养基体外二维培养。采用相差显微镜观察、MTT分析、PAS染色和脲酶法对培养的肝细胞生长及功能进行检测和分析。主要观察指标:肝细胞形态、活性,糖原水平,培养上清中的尿素浓度。结果:分离纯化的新生大鼠肝细胞总数1.0×106～2×106/肝,活力在90%以上,光镜下肝细胞呈圆形或卵圆形,核大而圆,胞体较成熟肝细胞小。通过多步低速离心可去除红细胞、其他非实质细胞和死亡的肝细胞,其纯度可达95%以上。肝细胞活性在培养初期即缓慢上升,至第3天时开始快速增殖,第11天时达到高峰,与第1天相比差异有显著性意义(P=0),但随后又缓慢降低,到15天时与第11天相比差异有显著性意义(P=0)培养的肝细胞贴壁生长,并保持肝细胞特异细胞形态。培养至第7天的肝细胞PAS染色呈强阳性,之后阳性细胞逐渐减少,至15d时可见少量阳性细胞。培养上清中尿素在培养初期基本没有变化,培养至第7天时显著下降。结论:组织块-胰酶冷消化法和HepatoZYME-SFM培养基二维培养为种简单有效的新生大鼠肝细胞分离培养方法。

肝组织工程支架评价方法研究

目的:以人肝细胞系HepG2作为种子细胞,建立一种细胞支架评价方法,为肝组织工程筛选合适支架。方法:将HepG2细胞接种在生物可降解聚合物支架——聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)、壳聚糖(3%CS)和丝素(2%SF)上,体外常规培养;采用四唑盐(MTT)比色法、HE染色和尿素氮检测试剂盒对接种在支架上HepG2细胞的生长、分布及功能情况进行检测。结果:培养在3种支架上的HepG2细胞均维持增殖状态,相比之下,丝素支架上的细胞增殖较快,而PLGA和壳聚糖支架上的细胞增殖相对缓慢;培养至第7d时,组织学检测显示丝素支架上的HepG2细胞分布均匀,数量最多;而在PLGA和壳聚糖支架上只能发现少量细胞;细胞功能检测显示丝素和PLGA支架上的尿素合成能力下降缓慢,而壳聚糖支架上的尿素合成能力快速下降。结论:3种支架均具有比较好的生物相容性;相比较而言,丝素更适合作为肝组织工程支架;该方法可用于批量筛选肝组织工程支架。

用新生大鼠肝细胞体外构建工程化肝组织

目的:在供体肝短缺的情况下,构建可植入的工程化肝组织具有重要的临床意义。实验尝试以新生大鼠肝细胞为种子细胞体外构建工程化肝组织,以期进一步的体内植入。方法:实验于2007-04/08在解放军总医院普通外科研究所完成。①实验材料:SPF级、出生24h以内的雄性SD新生大鼠。②实验过程:采用胰酶消化法获取新生大鼠肝细胞;以2×L-DMEM液(添加地塞米松10μg/L、表皮生长因子20μg/L、肝细胞生长因子40μg/L及胰岛素0.04U/mL)与液态鼠尾胶原等比例混合;再将肝细胞与胶原凝胶复合构建细胞/凝胶复合物,接种于培养板进行培养。③实验评估:培养后第1,3,5,7,9天,采用相差显微镜观察、四甲基偶氮唑盐比色法、苏木精-伊红染色和免疫组织化学染色分别对工程化组织的生长情况及组织形态特征进行观察,并对工程化组织的白蛋白合成功能及尿素的代谢水平进行评价。结果:①肝细胞与胶原凝胶复合后,细胞均匀的分布在复合物中。在整个培养过程中,肝细胞保持着稳定的细胞形态。②四甲基偶氮唑盐检测显示肝细胞活性在生长初期平缓下降,直至第5天时仍然保持75%的细胞活性,之后快速下降。③体外培养5d后,相差显微镜下观察显示肝细胞在胶原凝胶中呈三维立体生长,并保持肝细胞胞体圆形,核大而圆的特异形态;免疫组织化学证实这些肝细胞抗白蛋白抗体染色呈强阳性。④对培养上清中白蛋白和尿素的含量测定表明胶原凝胶中的肝细胞在培养初期保持着稳定的代谢合成功能。结论:用新生大鼠肝细胞及胶原构建出一种有功能的工程化肝组织模型,这种模型可以应用于今后的工程化肝组织研究。

以胶原凝胶为支架原位构建可注射型工程化肝

背景:为了解决肝移植供体的不足,最具潜力的肝组织工程技术悄然兴起,为肝组织的修复与功能重建开辟了新的前景。目的:探索一种以新生大鼠肝细胞为种子细胞,以胶原凝胶为支架材料,可原位注射的工程化肝组织构建方法。设计、时间及地点:以动物为观察对象的实验方法探索,于2007-03/2008-02在解放军总医院普通外科研究所完成。材料:成年雌性SD大鼠及出生24h以内的雄性新生SD大鼠。方法:以胰酶消化法获取新生大鼠肝细胞,以PKH26标记后与液态胶原复合,采用注射方法植入大鼠肝脏。主要观察指标:于肝细胞/胶原凝胶复合物植入当天及植入后第3,7天序贯取样、切片,分别行苏木精-伊红染色和白蛋白免疫组织化学染色后对"类肝组织"进行形态学观察,并观察植入细胞的示踪荧光。结果:①以胶原为基质构建的工程化肝组织能方便地植入到肝脏。②荧光显微镜观察到移植区域主要由PKH26阳性细胞组成。③苏木精-伊红染色显示,移植区域肝细胞在胶原凝胶中可存活、生长。④免疫组织化学染色证实植入肝细胞能够表达白蛋白。结论:以新生大鼠肝细胞/胶原凝胶为基础构建可原位注射的工程化肝组织是可行的,这种方法对于发展以组织工程为基础的原位肝脏重建具有良好的应用前景。

小鼠再生肝浸出液体外诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞样分化的研究

目的应用小鼠再生肝浸出液体外诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞样分化。方法利用2／3肝部分切除术后36h小鼠再生肝组织浸出液定向诱导小鼠骨髓间充质干细胞，在倒置显微镜下观察细胞形态，应用免疫荧光法鉴定细胞性质。结果骨髓间充质干细胞经小鼠再生肝浸出液诱导7d后，呈肝细胞样圆形，1～2周后免疫荧光染色可见细胞表达肝细胞标记物CK8、CK18和清蛋白。结论小鼠再生肝浸出液可诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞方向分化。

内毒素活化巨噬细胞早期和晚期基因表达的cDNA芯片分析

目的 利用 c DNA芯片技术分析内毒素活化的小鼠腹腔巨噬细胞早期和晚期基因表达 ,以更全面了解内毒素在感染、创伤反应中通过巨噬细胞介导的炎症和免疫反应。方法 以未刺激的和用 1mg/ L脂多糖 ( L PS)分别刺激 2 h(早期 )和 2 4 h(晚期 )的小鼠腹腔巨噬细胞制备 33P标记的 c DNA探针 ,并分别与小鼠 c DNA表达芯片 (含 1176个已知基因 )杂交。结果 巨噬细胞活化早期的 3倍差异表达基因为 6 9个 ,其中4 4个上调 ,2 5个下调 ;巨噬细胞活化晚期的 3倍差异表达基因中有 11个上调 ,2 6个下调 ;只有 8个基因同时出现于活化早期和晚期的差异表达基因中。许多转录因子、细胞内信号转导调节蛋白、炎症细胞因子和细胞凋亡相关基因的表达均发生了明显的调节变化。发现 BTB和 CNC同源 1( BACH1)、早期生长反应蛋白 2( EGR2 )、E4 7反应蛋白 1( EIP1)、Ngfi A结合蛋白 2 ( NAB2 )、成髓细胞白血病癌基因样蛋白 ( MYBL2 )、神经纤维癌蛋白基因 1( NF1)、睫状神经营养因子 ( CNTF)和 Sema4 A等一些以前未曾报道与 L PS诱导的巨噬细胞活化相关的基因。结论 采用 c DNA芯片技术了解内毒素诱导的巨噬细胞活化早期和晚期的综合基因表达信息 ,有助于更好地了解感染。

双特异性单抗对胃肠癌的体内杀伤作用

目的探讨抗CD3抗CEA双特异性单链抗体介导CIK细胞在体内杀伤胃肠癌的作用。方法分别将人胃低分化腺癌BGC823细胞和人结肠中分化腺癌SW1116细胞种植裸鼠后,建立裸鼠胃癌及肠癌模型,分为3组分别经尾静脉注入生理盐水、CIK细胞及CIK细胞+双特异性单抗,每3天治疗1次,共6次,取出肿瘤组织称重,并计算出各组的抑瘤率。结果在体内,CIK组和CIK+双抗组均可抑制肿瘤生长,对胃癌的抑瘤率分别为29.90%和44.33%。对结肠癌的抑瘤率分别为14.93%和38.81%。CIK+双抗组:胃癌及结肠癌的瘤体积、瘤重明显小于CIK组。结论 CIK细胞本身可以抑制肿瘤细胞的生长,在加入抗CD3抗CEA双特异性单链抗体后抑瘤作用明显增强。

肝十二指肠韧带内注射利多卡因对缺血再灌注损伤肝脏的影响

目的 :探讨肝十二指肠韧带内注射利多卡因减轻肝脏缺血 再灌注 (Ischemia reprefusion ,I R)损伤的有效性以及从蛋白质组水平研究其可能涉及的机制。方法 :4 6只SD大鼠随机分成I R组、利多卡因组和开腹组。检测各组血清丙氨酸转氨酶 (ALT)和门冬氨酸转氨酶 (AST) ,肝脏组织标本胎盘蓝染色分析。肝脏组织的蛋白质组学分析采用双向聚丙烯酰胺凝胶电泳 (2 DPAGE)、质谱 (MALDI TOF MS)方法。结果 :利多卡因组ALT和AST较I R组显著降低 (ALT :t=2 .5 99,P <0 .0 2 ;AST :t=2 .992 ,P <0 .0 1) ,胎盘蓝染色的无活性肝细胞较I R组也明显减少。利多卡因组的 2 DPAGE图谱较I R组发生了改变 ,质谱鉴定出 11个差异表达的蛋白质 ,其中 6个上调表达 ,5个下调表达。结论 :肝十二指肠韧带内注射利多卡因预处理有效地减轻了大鼠肝脏随后的I R损伤 ,是一种保护面临I R损伤肝脏的新方法。蛋白质组学研究可见 ,利多卡因预处理改变了肝脏I R后的蛋白质表达。

筛选适宜于构建工程化肝组织的凝胶材料支架

目的使用不同可注射性凝胶支架体外进行新生大鼠肝细胞立体培养,为后期体内植入筛选相容性较好的支架材料。方法使用胰酶冷消化法分离新生大鼠肝细胞。将肝细胞分别与纤维蛋白胶、壳聚糖凝胶、鼠尾胶原、透明质酸钠支架材料复合,形成工程化肝组织凝胶,接种于培养板中,并通过定期光镜来观察大鼠肝细胞,四唑盐(MTT)比色法评价细胞活性。溴甲酚绿法测上清白蛋白含量,脲酶比色法测定上清尿素含量。结果四组均可形成三维生长的工程化类肝样组织。培养第4天,生物蛋白胶及壳聚糖组的培养上清液中尿素含量达到高峰,分别为培养第1天的1.31倍和1.28倍,随后含量缓慢下降。培养第7天,新生大鼠肝细胞在纤维蛋白凝胶及壳聚糖凝胶中密集生长,同时MTT显示细胞活性及白蛋白分泌达到高峰,OD值分别为培养初期的1.11倍和1.17倍,上清白蛋白含量分别是初期的1.13倍和1.15倍。而在透明质酸钠及鼠尾胶原凝胶中则细胞生长缓慢,白蛋白及尿素含量持续下降。结论 4种可注射性支架中,壳聚糖和生物蛋白胶对于新生大鼠肝细胞生物相容性较好,透明质酸和鼠尾胶原较差,前两者更适合用于工程化肝组织的构建。

体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞定向分化肝样细胞

目的观察骨髓间充质干细胞体外诱导分化为肝样细胞。方法自大鼠的股骨中提取骨髓细胞,利用 Percoll 法行骨髓间充质干细胞分离、纯化。取第3代的骨髓间充质干细胞,应用肝细胞生长因子(HGF)20ng/ml 表皮生长因子(EGF)1.5μg/ml 联合诱导。两周后免疫荧光染色及逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)鉴定诱导后细胞白蛋白的 mRNA 的表达。结果诱导分化一周骨髓间充质干细胞变为圆形,两周后免疫荧光染色可见肝细胞标志物 CK18和白蛋白表达,RT-PCR 检测有白蛋白的 mRNA 的表达。结论骨髓间充质干细胞体外诱导能定向分化为肝样细胞。

肝脏部分切除对骨髓间充质干细胞定向肝细胞分化的影响

目的:探讨肝脏损伤对小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)向肝细胞诱导分化的影响。方法:昆明系小鼠分两组,分别行肝脏2/3切除和开关腹手术,分别于术后12 h,24 h,36 h,48 h,72 h后提取MSCs,取第3代的MSCs,流式细胞仪鉴定MSCs后,应用HGF联合EGF诱导,20 d后免疫荧光染色鉴定肝细胞标志物ALB,CK8,计数ALB阳性细胞数量和同视野细胞总数,计算阳性率。结果:诱导分化20 d,两组均有ALB、CK8表达,24 h时间点,实验组阳性率(10.41±0.11)%,对照组阳性率为(9.83±0.32)%,实验组与对照组阳性率比较差异有显著性意义;其余时间点实验组和对照组阳性率比较差异均无显著性意义(P>0.05)。结论:肝脏损伤后24 h,提取MSCs定向肝细胞的阳性率高。

HBV相关的原发性肝透明细胞癌组织CK19表达及其临床意义

目的探讨细胞角蛋白19（CK19）在原发性肝透明细胞癌（PCCCL）中的表达及其与患者预后的关系。方法收集2006年11月一2014年8月首都医科大学附属北京佑安医院术后病理活检证实为PCCCL的住院患者76例。采用免疫组化法检测癌组织CK19、P53、CD34、GPC-3和HepPar-1表达。应用Kaplan—Meier生存曲线和Wilcoxon检验分析CK19阳性与阴性的PCCCL患者的预后差异。结果在76例PCCCL组织中，CK19阳性9例（11．84％）；在肿瘤直径大于3cm患者，CK19阳性患者发生肿瘤远端转移为60．0％（3／5），显著高于CK19阴性患者的8．7％（2／23，P〈0．05）；经Kaplan—Meier和Log-rank检验，结果显示CK19阴性的PCCCL患者生存期为60W，显著长于CK19阳性的PCCCL患者（31W，P〈0．05）。结论PCCCL是一组异质性肿瘤，可以起源于CK19阳性的肝前体细胞，也可能转化自趋于分化成熟的肝细胞。PCCCL组织CK19阳性表达与患者的不良预后密切相关。

HBV相关肝癌组织HBsAg和HNF4α表达及其与组织学分化的关系

目的：探讨在乙型肝炎病毒（HBV）相关肝细胞癌（HCC）患者癌组织中HBsAg和肝细胞核因子4α（HNF4α）表达及其与组织学分化的关系。方法回顾性分析2008年11月～2013年3月首都医科大学附属北京佑安医院经术后病理学检查证实为HCC组织256例。采用免疫组化法检测HBsAg、HNF4α和磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3（GPC-3）表达。结果在256例HCC癌组织中，发现HBsAg阳性12例（4.7%）；在39例高分化、119例中分化和98例低分化肿瘤组织中，HBsAg阳性率分别为20.5%、1.7%和2.0%，前组显著高于后两组（P〈0.05）；HNF4α阳性百分比在高分化癌患者中为65.6%（21/32），显著高于中、低分化癌患者18.8%（3/16，P〈0.001）；在12例HBsAg阳性癌组织中，HNF4α阳性11例（91.7%），而在选择的36例HBsAg阴性癌组织中，HNF4α阳性13例（36.1%， P〈0.05）；在4例HBsAg阳性中分化和低分化HCC组织中，免疫组化显示GPC-3呈补丁样分布。结论 HBsAg在HBV相关HCC患者肿瘤细胞中的低表达可能与肿瘤细胞低表达HNF4α有关。

透明质酸支架构建工程化肝组织小块的初步研究

目的探索肝窦血管内皮细胞和肝细胞与透明质酸支架复合后构建工程化肝组织小块的可行性。方法分离小鼠肝细胞和肝窦血管内皮细胞,分别种植于透明质酸海绵状支架上培养,形成支架材料细胞复合体,植于小鼠肝包膜下肝组织表面。2周后将支架取出观察植入效果。结果分离获得的肝细胞和肝窦血管内皮细胞活力较高。构建的支架细胞复合物植入体内后与宿主肝组织紧密融合,可见移植物内有微血管形成,血管周围肝细胞聚集生长,结构类似正常肝组织。结论利用透明质酸支架复合肝窦血管内皮细胞和肝细胞构建工程化肝组织小块的方法可行。

尺骨鹰嘴骨折四种固定法的比较与选择

为给临床治疗尺骨鹰嘴骨折选择方法提供依据 ,对分别采用“8”字钢丝内固定 (A组 )、螺丝钉内固定 (B组 )、张力带钢丝内固定 (C组 )、鹰嘴钩外固定 (D组 ) 4种方法收治的 16 2例该病患者的临床资料进行了回顾性分析。依据远期临床功能恢复情况分优、良、可、差 4级标准进行疗效评价 ,结果达优良率者 ,A组为 6 2 .5 % ,B组为 6 5 .6 % ,C组为 94.3% ,D组为 96 .2 %。参照单位分析法统计处理显示 ,D组与C组疗效无显著差异 (P >0 .0 5 ) ,与A组和B组相差显著 (P <0 .0 5 ) ,C组优良率高于A组和B组 (P <0 .0 1)。认为治疗尺骨鹰嘴骨折 ,“8”字钢丝法、螺丝钉法不应作为常规、首选 ;张力带钢丝法为有效可靠的选择 ;鹰嘴钩法系最佳选择。

制动盘气孔缺陷的形成及防止措施

目前,国内汽车制动盘的出口市场已经形成一定规模,仅就铸件来说,出口量估计在20万t左右。同时国外市场对制动盘的技术要求较高,给国内生产出口制动盘企业的生产技术管理和质量控制提出了更高的要求。

牛津版初中英语教材的使用建议

《牛津初中英语》教材是为适应新课程改革而加以使用的，合理使用教材才能达到习得语言知识和文化意识，培养语言技能和情感态度、综合素质的目的，教师对教材的使用方法都成为教材能否发挥最大作用的重要影响因素，为广大教师合理利用该教材，笔者就此提出相关的建议。

中医手法加阶梯功能锻炼治疗腰椎间盘突出症50例

中医手法加阶梯功能锻炼治疗腰椎间盘突出症疗法,方法简便,疗效显著而持久,经随诊复发率明显下降.现将2008年6月至2011年6月我院收治的100例腰椎间盘突出症患者,采用随机分组治疗,现报告如下.

麝香跟痛散填充足跟垫治疗跟痛症临床观察

目的:观察麝香跟痛散填充足跟垫环形药垫治疗跟痛症临床疗效。方法:对105例跟痛症患者采用麝香跟痛散填充制成中空环形药垫,兼有中医外治及西医足跟垫双重功效治疗。结果:105例中,治愈60例,好转30例,无效15例,总有效率为85.7%。结论:麝香跟痛散填充足跟垫治疗跟痛症疗效显著。