组织工程骨体外构建和培养的相关技术进展

背景:细胞支架复合物在体外构建及成熟分化为骨组织工程骨是骨组织工程构建的必须过程,目前尚无统一方法及标准。目的:总结目前骨组织工程构建的技术与基本方法并讨论相关发展。方法:以"bone tissue engineering,cell biological scaffold,cell inoculation,seeding density,culture in vitro,bioreactor"为英文检索词,以"骨组织工程,生物支架,细胞接种,接种密度,体外培养,生物反应器"为中文检索词,检索PubMed数据库和中国期刊全文数据库1997年1月至2013年1月与骨组织工程骨体外构建和外培养相关文献,根据纳入排除标准,最终纳入44篇。结果与结论:生物支架作为骨组织工程种子细胞的载体,首要的前提是无菌,无菌状态的细胞支架复合物才能够存活。生物支架材料的灭菌有紫外线灭菌法,60Coγ射线灭菌法,体积分数75%乙醇浸泡,高压灭菌锅法,环氧乙烷灭菌等方法。60Coγ射线灭菌方法常在支架灭菌中成为较常选的方法。种子细胞的接种密度是影响种子细胞在支架上黏附生长及增殖的一个重要因素。细胞与支架材料的黏附受支架材料亲合力、细胞黏附力及重力等多方面因素的影响。目前阶段骨组织工程种子细胞接种方法分位静态接种和动态接种。每一种构建方法都各有优缺点,克服这些缺点以及形成统一的构建方法并充分应用临床是未来的发展方向。

两种入路手术治疗腰椎管狭窄症的疗效比较

目的比较单侧双通道入路间盘切除术(UBED)与经皮内镜椎板间入路间盘切除术(PEID)治疗腰椎管狭窄症的临床疗效。方法将手术治疗的46例腰椎管狭窄症患者根据入路方式不同分为UBED组(25例)和PEID组(21例)。比较两组腰背痛VAS评分、下肢痛VAS评分、腰椎JOA评分以及手术责任节段椎管横截面面积。结果患者均获得随访,时间3~5个月。腰背痛VAS评分:术后1个月PEID组低于UBED组(P<0.001),术后3个月两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。下肢痛VAS评分、腰椎JOA评分:两组术后1、3个月比较差异均无统计学意义(P>0.05)。术后手术责任节段椎管横截面面积及椎管改善率:UBED组均优于PEID组(P<0.05)。结论相较于PEID,UBED治疗腰椎管狭窄症具有减压范围广、椎管改善好的优点。

6枚万向椎弓根钉固定在胸腰椎骨折治疗中的应用

目的探讨6枚万向椎弓根钉固定用于胸腰椎骨折治疗的效果。方法对44例胸腰椎骨折患者经伤椎及上、下邻椎各置入2枚万向椎弓根钉固定。记录骨折愈合时间及手术前后胸腰痛VAS评分、伤椎Cobb角、内固定系统上位及下位邻近节段椎间高度指数、伤椎前缘高度比。结果患者均获得12个月随访。骨折均愈合,时间3~6个月。①胸腰痛VAS评分:术后7 d及1、3、6、12个月均低于术前(P<0.05);术后7 d、1个月、3个月随时间逐渐降低(P<0.05)。②伤椎Cobb角:术后7 d及1、3、6个月均小于术前(P<0.05),术后12个月与术前比较差异无统计学意义(P>0.05);术后1、3、6、12个月均大于术后7 d(P<0.05)。③内固定系统上位邻近节段椎间高度指数:术前及术后7 d、1个月、3个月比较差异均无统计学意义(P>0.05);术后6个月及12个月分别低于术前、术后7 d、术后1个月(P<0.05)。④内固定系统下位邻近节段椎间高度指数:术后7 d明显高于术前(P<0.05),术后1、3个月均低于术后7 d(P<0.05),且与术前比较差异无统计学意义(P>0.05);术后6个月及12个月分别低于术前、术后7 d、术后1个月(P<0.05)。⑤伤椎前缘高度比:术后7 d及1、3、6、12个月均高于术前(P<0.05);术后1、3、6、12个月均低于术后7 d(P<0.05)。结论6枚万向椎弓根钉固定用于胸腰椎骨折的治疗,可显著改善患者胸腰背疼痛,恢复椎体前缘高度,但也存在加快上位椎间盘退变的可能,对术后维持伤椎Cobb角无明显优势。

经骨形态发生蛋白7成骨预处理聚乳酸三维支架的体外培养

背景:为改善聚乳酸的细胞亲和性,前期实验在其表面加入骨形态发生蛋白7功能基团,制备了经骨形态发生蛋白成骨预处理的聚乳酸三维支架。目的:验证经骨形态发生蛋白成骨预处理聚乳酸三维支架与骨膜来源细胞的相容性。方法:取传至3代后成骨诱导分化的人骨膜来源细胞,实验组以1×10~9 L^(-1)的细胞浓度接种于含聚乳酸支架的培养板内,聚乳酸支架预先经含骨形态发生蛋白7的成骨诱导培养液浸泡24 h;对照组直接以1×10~9 L^(-1)的细胞浓度接种于培养板内。培养后1,3,5,7,9,11 d,采用CCK-8法检测细胞增殖能力;培养后3,6,9,12 d,电镜下观察细胞-支架复合体。结果与结论:1细胞增殖结果:两组细胞生长曲线均呈"S"型,实验组对数生长期细胞增殖较快,平稳期细胞数目明显下降,对照组平稳期细胞数目继续上升。2透射电镜观察结果:复合培养3-6 d时,支架表面细胞黏附数量逐渐增多,细胞生物状态良好,细胞器旺盛,至第9天,开始出现细胞老化及凋亡。3扫描电镜观察结果:复合培养3-9 d时,支架表面细胞黏附数量逐渐增多,增殖旺盛,至12 d时见凋亡细胞。4结果表明,经骨形态发生蛋白成骨预处理聚乳酸三维支架具有良好的细胞相容性,其与细胞复合培养1周为较佳的体外复合培养时间。

经椎弓根动态非融合技术治疗单节段腰椎退行性变疗效的Meta分析

目的 通过Meta分析比较经椎弓根动态非融合术和传统椎间融合术在治疗单节段腰椎退行性变疾病中的临床疗效。方法 计算机检索Pub Med、Embase及Cochrane library 3个数据库,由两名研究者对检索到的文献进行纳入与排除,评价文献质量后提取所需要的数据,应用Review Manager 5.3软件进行Meta分析。结果 共筛选出10篇文献,纳入539例患者,其中动态非融合组312例,椎间融合组227例。Meta分析结果显示,动态非融合组与椎间融合组在术后腰椎JOA、腰背痛VAS、下肢痛VAS、ODI上的差异均无统计学意义(P>0.05);两组术式对手术上位相邻节段ROM的影响差异具有统计学意义(MD=-1.65,95%CI:-2.92--0.38,P=0.01),而在手术下位相邻节段ROM差异无统计学意义(MD=0.55,95%CI:-1.19-2.30,P=0.54)。结论 经椎弓根动态非融合术可同样改善患者临床症状,提高手术疗效,但对保护手术相邻节段、预防退变短期疗效并不明显,需长期随访。

骨形态发生蛋白7诱导骨膜细胞体外构骨的超微结构

背景:骨形态发生蛋白被证实有成骨诱导作用,然而关于骨形态发生蛋白7诱导骨膜细胞成骨的超微结构研究尚未见报道。目的:观察骨膜细胞经成骨因子骨形态发生蛋白7诱导后的生物活性及超微结构。方法:实验取材于成人胫骨。分离出原代骨膜细胞后行常规体外培养,实验分为实验组和对照组。实验组加入骨形态发生蛋白7和细胞培养辅助剂,对照组仅仅加入了成骨细胞培养辅助剂。每组分别在第5,10,15天设3个时间点,每个时间点设3个样本,分别行钙结节的染色及采用相差显微镜观察大体形态结构,在透射电镜下观察超微形态结构。结果与结论:实验组和对照组形成的成骨细胞增殖良好,形态一致。细胞早期呈梭形,立体感强,饱满透明,分裂期呈短柱状或立方形,电镜下见成骨细胞内有大量的粗面内质网和高尔基复合体;后期细胞由长梭形逐渐变成宽梭和不规则形,后期射透电镜下可见细胞内有大量基质小泡,有膜包被,胞质内上有碱性磷酸酶及钙结合蛋白,泡内有钙盐结晶,成骨细胞的基底部和侧面出现突起与邻近的骨细胞突起相连。由骨形态发生蛋白7诱导的成骨细胞在体外增殖更快,细胞分裂及成骨速度更快。结果提示骨形态发生蛋白7在体外培养中具有明显增强成骨细胞增殖的能力。

人骨膜来源细胞在聚乳酸三维支架体外成骨的超微结构研究

目的探讨人骨膜来源细胞在聚乳酸（PLA）三维支架体外培养成骨的可行性及其超微结构特征。方法取材于成人胫骨骨膜，组织块法分离出骨膜细胞并体外培养传至第3代后进行定向诱导分化为骨膜来源成骨细胞，相差显微镜观察细胞形态特征，分为诱导组和未诱导组，分别在5、10、15、20d取3个样本，采用碱性磷酸酶（ALP）试剂盒法及钙结节VonKossa染色法检测ALP和钙结节的表达。经诱导分化的成骨细胞随机分为实验组和对照组，分别接种至经含骨形态发生蛋白．7成骨诱导剂预处理的PLA三维支架和普通二维细胞培养板，1、3、5、7、9、11d采用CCKl8法测量两组细胞的增殖能力，并绘制生长曲线；3、6、9、12d电镜下观察细胞在PLA的生长情况和超微形态特征。结果骨膜来源细胞经诱导分化其形态与成骨细胞相似，诱导组的ALP和钙结节染色阳性率明显高于未诱导组，差异均有统计学意义（P〈0．05）。实验组和对照组细胞生长曲线均呈“S”形，实验组对数生长期增殖较快，平稳期细胞数目明显下降，对照组平稳期数目则有上升，差异有统计学意义（P〈0．05）。电子显微镜观察体外骨膜来源成骨细胞具有良好的超微形态学结构。结论体外骨膜来源成骨细胞与PLA三维支架复合有良好的生物相容性、细胞增殖力和超微形态学结构；体外复合成活后应在第8，9天及时转入体内生长以发挥骨修复作用。

BMP4促进人骨膜来源细胞体外成软骨细胞分化

目的探讨细胞因子BMP4在骨膜来源细胞体外培养中的定向成软骨分化作用。方法采用人胫骨骨膜为材料，体外组织块法分离骨膜来源细胞，置于DMEM／F12完全培养基培养，倒置显微镜观察细胞形态，台盼蓝染色细胞计数法检测第3、9代骨膜来源细胞和BMP4诱导后细胞的增殖活性，绘制细胞生长曲线图。随机分为对照组、软骨诱导组和实验组，分别加入完全培养基、软骨诱导液和BMP4加软骨诱导液，第14和21天分别采用甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组化染色检测细胞的蛋白多糖和Ⅱ型胶原；定量PCR检测软骨基因Aggrecan、Ⅱ型胶原和SOX9mRNA表达。结果（1）骨膜来源细胞在体外贴壁生长，经成软骨诱导1周后可见类圆形细胞形成，2周后细胞呈多角形，甲苯胺蓝染色呈阳性；细胞生长曲线证实诱导分化后细胞与第3代至第9代细胞增殖能力相似。（2）第14和21天软骨细胞标志物阳性率（％）实验组蛋白多糖（分别为40．29±4．29、56．74±5．12）和Ⅱ型胶原（分别为19．27±3．71、38．31±4．25）较软骨诱导组（第14和21天蛋白多糖分别为28．12±3．25、41．23±4．18，11型胶原分别为10．24±1．21、15．28±2．23）明显升高（P〈0．05）。（3）定量PCR：实验组Aggrecan（25．76-t-0．57）、Ⅱ型胶原（6．48±0．48）、SOX9（2．91±0．18）mRNA表达均明显高于软骨诱导组（11．12±0．38、2．24±0．41、1．54±0．35）和对照组（2．37±0．24、1．12±0．31、1．07±0．22）（P〈0．05）。结论骨膜来源细胞体外增殖能力强，经诱导可定向成软骨分化，BMP4在体外具有明显促进骨膜来源细胞分化为软骨细胞的作用。

浅谈单细胞藻类的培养及在海水育苗中的不同效果

1种类搭配 在育苗生产中，幼体成长的好坏与饵料的营养直接相关。而多种饵料混合投喂是解决营养全面的最佳途径。如鲍的人工育苗中，在提供适量的底栖硅藻的同时，投喂含大量蛋白质的人工合成饵料以促进生长，而人工合成饵料中的相当一部分就是单胞藻，如螺旋藻、海泥中的底栖硅藻等；海参育苗已见的最佳投饵方法就是角毛藻、盐藻混和投喂，尽管使用其一甚至小新月菱形藻也能出苗，但受营养及培养条件（主要是施肥量）的影响，往往后期成活率有较大差异；扇贝育苗中尽管亲贝和幼虫都需要以金藻为主，但如果没有硅藻、扁藻等饵料补充，幼虫生命力差、附苗率低且容易脱苗，所以辅助饵料包括螺旋藻等在内，其比例约在113左右；鱼虾类育苗中尽管单细胞藻不作为直接饵料，但鱼虾幼体的主要饵料轮虫、卤虫、桡足类等的培养也必须以单胞藻为主，否则不仅培养困难，而且培养出的轮虫、卤虫等的营养价值大为逊色，不能为鱼虾类育苗有效利用，鱼虾幼体发育不良，究其原因就是缺乏单胞藻所培养出的动物性饵料营养不全面。实践证明，在海水育苗生产中多准备几种合适的单胞藻，对育苗成功绝对有保障作用。

浅谈单胞藻生产培养的施肥问题

如何培养出大量的可供海珍品育苗使用的单细胞藻类，一直是海水育苗生产工作者研究的重要课题。笔者根据20多年的教学和生产实践，发现教学中缺乏实践经验，对生产中的施肥认识不够、讲解不透，而生产中经营者过分注重育苗技术，忽视单胞藻生产培养中的施肥浓度调节，把培养失败片面归结为原生动物污染。单胞藻生产培养不稳定一度制约着海珍品人工育苗的正常发展。笔者认为施肥问题是稳定单胞藻生产培养的关键。