新一代测序技术无创产前检测胎儿FGFR3基因突变

目的探讨新一代测序技术(next-generation sequencing,NGS)无创产前筛查FGFR3相关疾病的可行性与准确率。方法 4例软骨发育不全、2例致死性侏儒Ⅰ型胎儿基因组DNA(g DNA)片段化后,以相应母体产后血浆游离DNA为背景,按照10%、6%、3%、1%、0.5%的浓度进行稀释,形成30例阳性模拟样本,建立孕妇血浆游离DNA模型,同时采集13例阴性对照孕妇血浆游离DNA,运用NGS技术分别检测FGFR3致病突变位点,计算检测灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值。结果 30例模拟样本中,胎儿g DNA浓度为10%、6%、3%、1%、0.5%时,突变检出例数分别为6/6、6/6、6/6、3/6、1/6,13例阴性突变检出例数为0/13;胎儿g DNA浓度≥3%时,NGS的灵敏度为100%(95%CI:81.5%~100%),特异度为100%(95%CI:75.3%~100%),阳性预测值为100%(95%CI:81.5%~100%),阴性预测值为100%(95%CI:75.3%~100%)。结论胎儿g DNA浓度≥3%时,NGS可以在孕妇血浆游离DNA模型中准确检出胎儿FGFR3基因突变,提示基于NGS技术的无创产前检测在新发突变或父源遗传疾病的产前诊断领域具有一定的应用前景。

低深度测序在检测单细胞染色体微小变异中的应用探索

旨在探讨低深度测序在检测单细胞染色体微小变异中的应用。以经过比较基因组杂交(array CGH,a CGH)检测的5例阳性细胞系为研究对象,从中分离的单细胞分别用两种单细胞扩增试剂盒进行扩增,采用Hiseq2000测序平台进行全基因组测序,然后进行生物信息学分析,将检测结果与已被a CGH证实的结果进行比较。结果显示,5个单细胞的全基因组扩增成功,通过低深度测序均获得明确的检测结果。在用Genome Plex?Single Cell WGA Kit试剂盒的处理中检出区域与a CGH检测区域均有80%以上的重叠,1个样本检出了8 Mb(Megabase)左右的假阳性;在用Pico PLEX?WGA Kit试剂盒处理时检出信号与a CGH区域也有80%以上的重叠且无假阳性信号产生。证实在数据量为0.1 X左右时可以检出单细胞染色体上7 Mb以上的拷贝数变异。

高通量测序技术用于无创产前检测FGFR3相关骨骼发育不良疾病的可行性研究

先天性软骨发育不全(achondroplasia,ACH,OMIM:100800)和致死性骨发育不全(thanatophoric dysplasia,TD type Ⅰ,OMIM:187600;TD type Ⅱ,OMIM:187601)由成纤维细胞生长因子受体3(fibroblast growth factor receptor 3,FGFR3)基因的杂合点突变导致,是胎儿期较常见的常染色体显性遗传疾病,多为新发突变引起。先天性软骨发育不全通常是非致死性的,发生率为0.36~0.60/10 000例活产儿,胎儿期临床表现为25孕周后超声显示胎儿长骨明显短小。ACH和TD发现时往往已进入晚孕期,临床处理困难。本病99%为FGFR3 c.1138G>A突变所致。

孕妇血浆中胎儿游离DNA浓度检测新方法

目的:准确检测胎儿游离DNA占孕妇血浆中总游离DNA的比例,即胎儿游离DNA浓度。方法:收集孕有正常男胎的孕妇血浆30例,孕有正常女胎的孕妇血浆2例,其中10例与对照组孕周相同的正常男胎样本作为实验组。对照组为5例孕有21三体(T21)男胎的孕妇血浆。分别提取孕妇血浆中的游离DNA,应用多重PCR结合高通量测序技术检测胎儿特异性的单核苷酸多态性位点(SNP),以此作为胎儿DNA标记物,以计算孕妇血浆中胎儿游离DNA的浓度。此外,采用基于Y染色体(ChrY)特异基因及目标区域捕获测序的方法计算相同样本的胎儿游离DNA浓度。结果:(1)新方法检测的胎儿游离DNA浓度结果与ChrY及目标区域捕获测序计算的结果一致,无显著差异(P>0.05),且具有较高的一致性(R2=0.982)。(2)孕有21三体男胎组中胎儿游离DNA浓度(17.3%±4.7%)明显高于相同孕周的孕有正常男胎组(11.8%±3.4%),两组胎儿游离DNA浓度存在差异(P<0.05)。结论:多重PCR结合高通量测序技术能够准确计算孕妇血浆中的胎儿游离DNA浓度,具备较强的临床应用价值。