成脂诱导剂通过PP2Ac调控人肝星状细胞活化的体外研究

目的:研究成脂诱导剂MDI对活化的人肝星状细胞的作用及其机制。方法:体外培养人肝星状细胞系LX-2细胞,实验分为4组,即空白对照组、溶剂对照组、重组人转化生长因子β1(TGF-β1)组、TGF-β1+MDI组。油红O染色法检测细胞内脂滴变化,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测肝纤维化标志物肌动蛋白α2(ACTA2)、Ⅰ型胶原蛋白α1(COL1A1)、金属蛋白酶组织抑制剂1(TIMP1)基因相对表达量。线粒体特异性荧光探针检测TGF-β1/MDI干预后LX-2细胞内线粒体数量的变化。采用western blotting法检测各组蛋白磷酸酶2A催化性C亚基(PP2Ac)蛋白表达。结果:与空白对照组和溶剂对照组比较,TGF-β1组LX-2细胞胞体增大、呈多边形且胞质增多、未见明显脂滴、线粒体数量增加,肝纤维化标志物ACTA2、COL1A1和TIMP-1mRNA表达水平以及PP2Ac去甲基化蛋白表达水平升高(均P<0.01)。与TGF-β1组比较,TGF-β1+MDI组细胞变小、胞质内小脂滴数量增加、线粒体数量减少,ACTA2、COL1A1和TIMP-1 m RNA表达水平以及PP2Ac去甲基化蛋白表达水平降低(均P<0.05)。结论:TGF-β1和MDI可能通过调控肝星状细胞的PP2Ac去甲基化水平调控人肝星状细胞活化,且与脂质生成以及线粒体数量有关。

牛磺酸影响人外周血T淋巴细胞增殖及分化功能的体外研究

目的:研究牛磺酸(Tau)对人外周血T淋巴细胞体外活化增殖及分化的影响及其作用机制。方法:无菌分离健康志愿者外周血淋巴细胞,建立植物凝集素(PHA)刺激T细胞体外活化增殖模型。实验设置对照组(control组)、PHA刺激组(PHA5μg/mL组)及Tau处理组(PHA+Tau 80 mmol/L组、PHA+Tau 160 mmol/L组)。细胞计数试剂盒(CCK-8)法检测T淋巴细胞增殖率;瑞—吉染色法观察细胞形态及计算转化率;实时荧光定量PCR检测T细胞增殖标志物Ki67,Th1转录因子T-bet及细胞因子干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α),Th2转录因子GATA-3及白介素-4/6(IL-4/6),凋亡相关因子Fas、FasL基因表达水平;活性氧(ROS)试剂盒检测细胞内ROS水平。结果:与control组相比,PHA 5μg/mL组T淋巴细胞转化率、增殖率、增殖标志物Ki67、Th1相关因子T-bet、IFN-γ、TNF-α、凋亡相关因子Fas基因表达及胞内ROS水平升高(P<0.05),凋亡相关因子FasL基因,Th2相关因子GATA-3、IL-6基因表达水平降低(P<0.05)。与PHA 5μg/mL组相比,PHA+Tau 80 mmol/L组与PHA+Tau 160 mmol/L组T淋巴细胞转化率、增殖率、Ki67基因表达及胞内ROS水平均下降(P<0.05),Th2相关因子IL-4、IL-6基因表达水平均升高(P<0.05),Th1相关因子IFN-γ、FasL基因表达水平差异均无统计学意义(P>0.05),PHA+Tau 80 mmol/L组Th1相关因子T-bet、TNF-α、Th2相关因子GATA-3及Fas基因表达水平差异无统计学意义(P>0.05),PHA+Tau 160 mmol/L组Th1相关因子T-bet、TNF-α、Th2相关因子GATA-3及Fas基因表达水平升高(P<0.05)。结论:Tau可能通过下调Ki67表达和增强Fas-AICD途径抑制T细胞增殖转化,并可能通过降低胞内ROS含量,提高Th1/Th2活化水平,调节Th1/Th2平衡偏向Th1分化,发挥调节T淋巴细胞活化增殖及分化的作用。

绿原酸对人外周血T淋巴细胞体外增殖及免疫调节功能的影响

目的绿原酸对T淋巴细胞的影响尚不清楚。文中旨在探讨绿原酸对植物凝集素(PHA)刺激人外周血T淋巴细胞体外增殖及免疫调节功能的影响。方法采用Ficoll离心法分离人外周血单个核细胞,分为对照组、PHA组、PHA+绿原酸50μg/mL组、PHA+绿原酸100μg/mL组。CCK-8法检测细胞增殖,瑞氏-吉姆萨染色观察细胞形态,实时荧光定量PCR检测T细胞增殖标志物Ki-67,Th1细胞因子IFN-γ、TNF-α,转录因子T-bet和Th2细胞因子IL-4、IL-13及转录因子GATA-3的mRNA表达水平;活性氧试剂盒检测细胞内ROS变化。结果与对照组比,PHA组刺激后T细胞明显增殖并转化为淋巴母细胞,增殖标志物Ki-67和Th1相关因子IFN-γ、TNF-α、T-bet mRNA表达水平明显升高(P<0.05),Th2相关因子IL-4、IL-13的表达上升(P>0.05),GATA-3 mRNA表达明显下降(P<0.01),胞内ROS水平明显增加(P<0.01);与PHA组比较,PHA+绿原酸50μg/mL组、PHA+绿原酸100μg/mL组处理后T细胞增殖、转化率和Ki-67、IFN-γ和T-bet mRNA表达水平显著降低(P<0.05),IL-4、IL-13、GATA-3 mRNA水平显著增加(P<0.05),胞内ROS水平明显降低(P<0.01),且呈剂量依赖性。结论绿原酸可抑制人外周血T淋巴细胞体外增殖,并可能通过下调ROS水平、抑制Th1因子的表达促进Th2分化发挥免疫调节功能。

LCMT1过表达对M2型巨噬细胞极化的影响

目的:通过慢病毒载体构建亮氨酸羟基甲基转移酶1(LCMT1)过表达THP-1细胞株,探讨LCMT1对THP-1细胞和THP-1源性巨噬细胞M2型极化的调控作用。方法:利用慢病毒技术,构建LCMT1过表达载体。设置blank组、OE-control组和OE-LCMT1组。荧光显微镜观察各组细胞的绿色荧光,细胞计数试剂盒(CCK-8)法检测各组细胞增殖情况,实时荧光定量PCR和免疫印迹法检测LCMT1 mRNA和蛋白表达水平以及PP2Ac甲基化相关蛋白表达水平。将THP-1细胞经100 nmol/L佛波酯(PMA)处理48 h后诱导分化为M0型巨噬细胞;M0型巨噬细胞经20 ng/mL白细胞介素4(IL-4)刺激48 h,诱导分化为M2型巨噬细胞。实时荧光定量PCR检测M2型巨噬细胞极化标志物c型甘露糖受体1(MRC-1)、CC趋化因子配体22(CCL22)、树突状细胞特异性细胞间黏附分子结合非整合素(CD209)的mRNA表达。结果:与blank组相比,OE-control和OE-LCMT1组表达绿色荧光,OE-control组的增殖曲线下降(P<0.001),LCMT1和PP2Ac甲基化相关蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05);与OE-control组相比,OE-LCMT1组增殖曲线下降(P<0.05),LCMT1和PP2Ac甲基化蛋白表达升高(P<0.05),PPME-1和PP2Ac去甲基化蛋白表达降低(P<0.01),总PP2Ac蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。与Blank M0组相比,Blank M2组的M2极化标志物MRC-1、CD209、CCL22 mRNA水平升高(P<0.05);与OE-control M2组比较,OE-LCMT1 M2组的M2极化标志物MRC-1、CD209、CCL22 mRNA水平降低(P<0.05)。结论:成功构建了LCMT1过表达的THP-1细胞株,LCMT1过表达可抑制THP-1细胞的增殖;维持总PP2Ac蛋白水平,增强PP2Ac甲基化并伴随PPME-1和PP2Ac去甲基化水平降低;下调M2型巨噬细胞极化标志物的表达,抑制M2型巨噬细胞极化。

4-辛基衣康酸抑制糖酵解调控M2型巨噬细胞极化

目的:研究4-辛基衣康酸(4OI)对M2型巨噬细胞(Mφ)极化的干预作用,初步探讨糖酵解及脂肪酸氧化在其中的作用机制。方法:将Mφ分为M0组(100 nmol/L佛波酯刺激48 h诱导为M0型)、M2组[M0组基础上用20 ng/mL白细胞介素4(IL-4)刺激48 h诱导为M2型]、M2+4OI-L组(M2组基础上用100μmol/L 4OI处理12 h)、M2+4OI-H组(M2组基础上用200μmol/L 4OI处理12 h)。实时荧光定量PCR检测M2型Mφ极化相关标志物白细胞介素10(IL-10)、甘露糖受体(MRC-1)、细胞趋化因子(CCL-22)、DC特异性细胞间黏附分子3结合非整合素(CD209)、细胞因子信号抑制物(SOCS1)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPAR-γ)、脂肪酸氧化限速酶碱棕榈酰基转移酶-1α(CPT-1α)的mRNA表达水平;微量法酶活性试剂盒检测糖酵解限速酶己糖激酶(HK)和丙酮酸激酶(PK)活性,刃天青法检测细胞内呼吸链代谢酶活性。结果:M0极化为M2时,与M0组比较,伪足伸出细胞和梭形细胞占比和M2型极化相关标志物CCL-22、IL-10、MRC-1、CD209、SOCS1和PPAR-γmRNA表达水平上升(P<0.01);HK和PK活性升高(P<0.05);CPT-1αmRNA水平和线粒体呼吸链代谢酶活性升高(P<0.01)。4OI干预后,与M2组比较,伪足伸出细胞和梭形细胞占比和M2型极化相关标志物CCL-22、IL-10、MRC-1、CD209、SOCS1和PPAR-γmRNA表达水平下降(P<0.05);HK和PK活性降低(P<0.05);CPT-1αmRNA水平进一步升高(P<0.01);线粒体呼吸链代谢酶活性无明显变化。结论:4OI可能通过抑制M2型Mφ糖酵解降低M2型Mφ极化相关标志物的表达,通过进一步促进脂肪酸氧化水平,维持M2细胞内线粒体呼吸链代谢酶活性和细胞氧化磷酸化稳定。