组蛋白去甲基化酶KDM5A调控H3K4me3参与神经管畸形 发生的分子机制

神经管畸形(NTDs)的病因与防治是出生缺陷领域研究的重点,叶酸可以预防神经管畸形但其机制不明。本文借助低叶酸细胞模型和低叶酸NTDs小鼠模型通过染色质免疫共沉淀、Cut&Tag等技术,探讨了组蛋白去甲基化酶lysine demethylase 5A(KDM5A)及其调控的下游组蛋白H3K4me3修饰在叶酸缺乏导致的NTDs发生中的潜在分子机制。结果显示,低叶酸的细胞模型中,qRT-PCR、Western印迹结果显示,KDM5A分子表达明显下降(P<0.05)。作为组蛋白H3K4me3调控的上游关键酶,进一步通过染色质免疫共沉淀ChIP、ChIP-qPCR实验证实,叶酸缺乏下组蛋白H3K4me3在神经发育基因Axin 2和Atoh 1基因启动子区富集增加(P<0.05)。通过构建KDM5A基因敲除细胞模型,借助Cut&Tag试验证实,KDM5A基因敲除后H3K4me3主要富集在神经发育基因上。最后在低叶酸导致的NTDs小鼠模型的脑组织中,RT-qPCR、Western印迹以及ChIP-qPCR实验显示,E9.5 d的NTDs胎鼠脑组织中KDM5A表达下降(P<0.05),Axin2、Atoh1表达升高(P<0.05),Axin2、Atoh 1基因启动子区的H3K4me3富集增多(P<0.05)。综上所述,KDM5A蛋白在叶酸缺乏导致的NTDs中发挥重要作用,其可通过调控下游H3K4me3进而调控神经发育靶基因Axin2、Atoh 1异常表达,介导NTDs的发生。本研究从叶酸缺乏介导KDM5A调控组蛋白修饰来探讨NTDs的发病机制,为降低出生缺陷,促进生殖健康提供依据。

低叶酸和维甲酸诱导神经管畸形小鼠模型胎脑的转录物组学分析

神经管畸形(neural tube defects,NTDs)是一类中枢神经系统相关的重大出生缺陷型疾病。随着孕龄期妇女叶酸增补政策的推广,其发病率逐年下降致临床标本不易获取,因此,建立可靠的动物模型来研究NTDs的致病机制尤为重要。本研究分别通过低叶酸联合甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)建立的诱导NTDs小鼠模型和维甲酸(retinoic acid,RA)诱导建立的NTDs小鼠模型,对NTDs胎鼠脑组织进行转录物组测序(transcriptome sequencing,RNA-seq)并分析差异表达谱,最后,通过实时荧光定量PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)进行结果验证。结果显示,低叶酸联合MTX诱导的胎鼠NTDs发生率为21.7%;RA诱导的胎鼠出现了强烈的致畸现象,畸形率为73.2%。相比正常胎鼠,低叶酸联合MTX诱导的NTDs小鼠组筛选出1443个差异表达基因(differentially expression genes,DEGs);RA诱导NTDs小鼠组筛选出3070个DEGs。对DEGs进行生物信息学分析,GO富集显示,上调基因主要参与前后轴发育、区域化和模式分化过程等生物学过程;KEGG富集显示,上调基因与心肌收缩、心肌病、神经活性配体-受体相互作用等信号通路相关。对2种模型鼠的DEGs进行Veen交集分析,结果显示,共有132个DEGs在2组模型中显著上调,其中包括Hox基因家族。通过RT-qPCR进行验证,发现与RNA-seq的结果一致。本研究对2种NTDs小鼠胎脑进行RNA-seq和差异表达谱分析,发现Hox的异常表达可能导致了NTDs的发生,为后续发病机制的研究提供了探索与思考。

人诱导多能干细胞来源功能性胰岛β细胞的体外定向分化方法的建立

1型糖尿病是由胰岛β细胞功能受损、胰岛素分泌不足所致,目前,主要通过外源性胰岛素补充来治疗,但外源性胰岛素无法精准调控血糖,严重低血糖可危及生命。胰岛移植是一种替代疗法,但面临器官供体不足和异种来源胰岛β细胞存在人畜共患病交叉感染风险的问题。因此,获得足量且安全的胰岛β细胞是1型糖尿病细胞治疗面临的难题。本研究旨在通过人诱导多能干细胞(human induced pluripotent stem cells,hiPSCs)在体外向胰岛β细胞分化,提供一种潜在的1型糖尿病治疗新策略。为实现这一目标,我们采用了结合2D和3D培养系统的分化策略,模拟胰岛β细胞的体内发育环境,并使用多种生长因子调节在胰腺发育和β细胞分化中发挥重要作用的关键信号包括Notch信号通路(Notch signaling pathway)、Wnt信号通路(Wnt signaling pathway)、TGF-β/Smad信号通路(TGF-β/Smad signaling pathway)等,在体外将hiPSC定向诱导分化至胰岛β细胞。结果显示,在2D、3D结合的培养条件下,分化过程中定型内胚层细胞,胰腺祖细胞,胰腺内分泌细胞及胰岛β细胞阶段的特异性基因的表达显著提高(P<0.05),并在胰岛素含量及葡萄糖刺激后表现出显著增强的胰岛素分泌能力(P<0.05)。总之,本研究成功建立了一种从hiPSC到功能性胰岛β细胞的分化策略,为1型糖尿病提供了一种新的细胞治疗途径。这种方法不仅为研究胰岛β细胞的发育生物学提供了新的工具,也为临床应用提供了一种潜在的胰岛β细胞来源,有望解决现有治疗方法的局限性。

诱导多能干细胞来源的间充质干细胞的治疗潜力与应用风险

诱导多能干细胞衍生的间充质干细胞(iMSC)已被提出作为原代间充质干细胞(MSC)的替代来源,在疾病治疗相关研究中也显示出多种优势。但是iMSC更适用于何种疾病类型,以及是否具有潜在的风险均未被充分阐明。本研究利用公共数据库中的高通量测序数据,将iMSC与骨髓源的MSC(BM-MSC)、脂肪源的MSC(AD-MSC)和脐带源的MSC(UC-MSC)进行对比,通过不同生物信息学方法,包括差异表达基因分析、功能富集分析、蛋白质相互作用网络分析及CMap数据库筛选,结果表明,iMSC具有独特的基因转录特征,与3种常用的MSC在基因表达上存在显著差异,特别是在神经、肌肉发育和免疫调节相关基因表达上;差异基因的功能富集分析进一步证实,iMSC在神经相关疾病治疗中表现出潜在优势,同时具有较低的免疫原性,但也存在较高的成瘤性风险;通过CMap数据库分析,识别了可能抑制iMSC成瘤性的基因靶点和小分子抑制剂,为降低iMSC应用风险提供了可能的策略。综上所述,iMSC作为细胞治疗的潜在来源,在神经疾病治疗中具有潜在优势,但其安全性需通过更多实验和临床研究来验证。

大肠癌病人粪便和组织中APC基因突变的研究

[目的]探寻一种无创伤性的早期诊断大肠癌的方法。[方法]采用聚合酶链反应—单链构象多态性(PCR—SSCP)技术检测大肠肿瘤病人粪便脱落细胞和组织APC基因突变并加以分析比较。[结果]肿瘤组织突变率为44%(19/43)。患者粪便脱落细胞APC基因的突变率为37.75%(16/43),腺瘤和大肠癌APC基因突变分别为25%(2/8)和40%(14/35)。组织粪便APC基因突变率相比差异无统计学意义(χ2检验P﹥0.05)。两者一致性检验结果kappa值为0.8449,一致性极好。正常组织APC基因未发现有突变。[结论]在粪便能够检测出APC基因突变,且与组织检测到的突变一致性极好,所以大肠肿瘤粪便的APC基因检测有望成为大肠肿瘤早期诊断和人群筛检的最优方案。

蚯蚓体腔液抗病毒活性及其机制的研究

[目的]以赤子爱胜蚓为原料,研究其体腔液的抗病毒活性及可能的机制,为新型抗病毒药物的开发提供思路。[方法]用分光光度法和琼脂糖凝胶电泳法测定蚯蚓体腔液蛋白酶活性和核酸酶活性;用鸡胚培养检测其抗流感病毒的活性,乙型肝炎病毒表面抗原及e抗原诊断试剂盒检测其对乙型肝炎病毒表面抗原及e抗原的破坏作用。[结果]蚯蚓体腔液具有蛋白酶活性、核酸酶活性和抗病毒活性;各种不同浓度的蚯蚓体腔液对流感病毒的增殖都有显著的抑制作用,且可以抑制乙型肝炎病毒表面抗原和e抗原表达,呈浓度依赖关系。[结论]蚯蚓体腔液具有抗病毒活性,其可能机制是蛋白酶、核酸酶及各种活性成分单独和/或协同作用的结果。

医学院校生物化学多元化教学改革的实践与思考

医学生物化学课程特点、不同特质学生群体及现代社会对医学人才的综合素质培养要求促使医学生物化学的教学方式需要结合学院实际情况进行多样化教学方式的改革。在传统授课的基础上,结合小班讨论课,思维导图,教师讲座与学生自学等多种教学方式,能够很好地培养学生积极自觉获取知识能力,表达、组织语言能力,与临床实践结合能力,系统条理性学习能力及团队合作能力。同时还能使学生掌握最新科研资讯,启发探索未知领域的渴望。

大肠腺瘤及癌组织APC基因突变分析

目的探讨腺瘤、大肠癌组织与APC基因突变的关系。方法41例大肠癌与腺瘤组织标本,采用银染单链构相多态性技术分析APC基因突变情况。结果35例原发性结、直肠癌组织有16例发生APC基因突变,突变率为45.7%。8例腺瘤组织检出突变3例,突变率为37.5%。APC基因在散发性大肠腺瘤与大肠癌中均有较高突变频率,两者差异无统计学意义。结果还表明,APC基因突变与年龄、性别、肿瘤性质、位置、类型、分期、淋巴结转移无关。结论APC基因突变在大肠腺瘤阶段就出现,属于大肠癌发生的早期阶段。检测APC基因突变能预测腺瘤的癌变倾向,有助于早期发现大肠癌。

盐析法浓缩鱿鱼鱼油中多烯脂肪酸的研究

目的 浓缩鱼油中多烯脂肪酸。方法 盐析法。结果 皂化液于不同温度放置 ,可得到含ω(DHA)为 2 0 %～ 2 8%、ω(EPA)为 12 %～ 19%的浓缩鱼油。结论 皂化液放置温度越低 ,多烯脂肪酸中DHA、EPA含量越高 ,提取率越低。用本法可得到不同档次的鱼油产品 ,为工业生产浓缩鱼油提供依据。

蚯蚓体内一组脱氧核糖核酸酶的酶学性质研究

目的:研究一组新型蚯蚓脱氧核糖核酸酶(earthworm desoxyribonucleases,EWDs)的主要生化性质。方法:采用SDS-PAGE、MALDI-TOF、紫外分光光度方法。结果:确定了EWD1,EWD2、EWD3(总称为:EWDs)的分子量分别为157.2kDa,69.1kDa和63.5kDa。37℃,pH4.6以小牛胸腺DNA为底物时,EWDs的Km值分别为1.58mg/ml,3.95mg/ml,1.52mg/ml;Vmax分别为5.36mg/(ml·min),2.87mg/(ml·min),4.89mg/(ml·min)。EWDs在55℃保温10min,酶活性完全丧失,在40℃以下酶活性都比较稳定。这3种脱氧核糖核酸酶最适pH值分别是5.2,4.4,4.8,酸性条件下较稳定。Mn2+,Ca2+是蚯蚓组织脱氧核糖核酸酶EWD1,EWD2,EWD3的抑制剂,Mg2+对EWD3有较明显的抑制作用。结论:蚯蚓组织中发现的脱氧核糖核酸酶EWDs具有独特的酶学特征,不同于已经发现的DNaseⅠ和DNaseⅡ,是种新型的脱氧核糖核酸酶,但其作用机理和分类有待于进一步的研究和归类。

子宫内膜中的成体干细胞

背景:近年来子宫干细胞尤其是子宫内膜干细胞研究有了新的突破,多个学者用不同方式证明了子宫内膜干细胞的存在。目的:介绍子宫干细胞存在的依据、位置及表面标志物。方法:应用计算机检索1995-01/2010-12清华同方数据库相关文章,检索词为"子宫内膜干细胞",并限定文章语言种类为中文。同时计算机检索PudMed数据库相关文章,检索词为"endometrium stemcell",并限定文章语言种类为English。共检索到文献233篇,最终纳入符合标准的文献30篇。结果与结论:近年来子宫内膜干细胞的分离与鉴定研究有了很大的进展,但子宫内膜干细胞的特异性标志物仍在探索中。文章就克隆形成能力、标记滞留细胞实验及组织重建能力等多种方法对子宫内膜干细胞存在的可能性,存在部位以及可能的表面标志物等进行了综述。

大肠癌P16基因异常表达危险因素的研究

目的 :探讨大肠癌 P16基因异常表达的危险因素。方法 :用免疫组化方法 ,将从山西省 4所综合性医院随机选取 110例原发性大肠癌手术病人 ,病例划分为 P16缺失表达组 (阳性组 )和未缺失表达组 (阴性组 )。应用病例 -病例研究方法及 SAS软件包进行因素分析。结果 :P16基因表达缺失率为 5 1.8% (5 7/ 110 ) ;单因素分析结果 ,有两个因素与 P16异常表达有联系 ,分别是好吃肥肉 (OR=2 .0 4 81) ,癌家族史 (OR=13.80 92 ) ;多因素非条件 logistic回归分析 ,有 3个因素进入回归模型 ,分别是吸烟年数 (OR=1.0 6 0 ) ,好吃肥肉 (OR=3.5 36 ) ,癌家族史 (OR=37.815 ) ;趋势 χ2检验发现吸烟年数与 P16基因表达缺失无明显剂量反应关系 ,但吸烟 4 0年以上组的 OR值是吸烟 2 0年以下组的 2 .9倍 ,家族患肿瘤人数与 P16基因表达缺失有明显剂量反应关系 (χ2 =15 3.38,P<0 .0 0 1)。结论 :在暴露于危险因素至癌变过程中 ,P16基因表达缺失可能与吸烟年数、好吃肥肉、癌家族史危险因素有关。

P16蛋白在大肠癌中的表达与预后的关系

目的探讨P16蛋白在大肠癌中表达及预后的关系。方法应用SP免疫组织化学法检测了P16蛋白在89例大肠癌组织中的表达。结果P16蛋白表达缺失45例,缺失率为50.6%,P16蛋白随着Duke分期级别升高,缺失率越来越高,且差异有统计学意义;有淋巴结转移组P16的缺失率比无淋巴结转移组高;P16的缺失表达与大肠癌患者的生存时间有关(P<0.05);P16缺失表达的患者预后较差。结论P16表达与Duke分期、淋巴结转移和患者生存时间有关。P16基因表达可能为影响患者预后的一个重要因素。

提高生物化学实验教学质量的思考

在生化实验教学中，改填鸭式教学为启迪性教学；借评估契机，全面推动实验室建设，调整实验课内容。一切以提高学生创造性思维的发展为目的，努力为学生创造良好的学习环境，才能在教学中培养出创造性的医学人才，以适应社会发展的需要。

蚯蚓脱氧核糖核酸酶的底物特异性及降解产物的特性

目的研究蚯蚓组织中一种新型脱氧核糖核酸酶(EWD)的底物特异性及降解产物的特性。方法采用ZOR-BAX-Oligo柱-HPLC、琼脂糖凝胶电泳、紫外分光光度法等技术,分析EWD对环状质粒DNA、线状λ-DNA、大肠杆菌基因组的降解作用,及对真核鲱精DNA、单链DNA等的降解中间产物和终产物的特性,并观察其对RNA的降解作用。结果EWD对这几种DNA均有降解作用,降解产物为较均一的、小于18bp的寡核苷酸。但EWD对RNA无降解作用。结论EWD为脱氧核糖核酸内切酶类。

p16蛋白在大肠癌中的表达及意义

目的 研究p16蛋白在大肠癌中的表达及意义。方法 应用免疫组化ABC法 ,在 70例原发性大肠癌和 2 5例正常大肠黏膜组织中检测 p16蛋白的表达。 结果 p16蛋白在癌组织中表达缺失率为 62 9% ( 4 4/70 ) ,在正常组织为 16% ( 16/2 1) ,p16蛋白表达随着Duke分期级别升高 ,缺失率越来越高 ,且有显著性差异。 3 8例淋巴结转移的大肠癌中 ,有 2 5例 p16蛋白表达缺失 ,缺失率为 72 % ,而 3 2例无转移者有 19例 p16蛋白表达缺失 5 3 2 % ,两组的缺失率表达有显著性差异。 结论 大肠癌发生过程中 ,存在 p16蛋白表达的异常 ,且 p16蛋白表达缺失与Duke分期和大肠癌淋巴结转移有关。

低氧预处理人脐带间充质干细胞促进其源性外泌体对心肌梗死后心肌损伤的修复

背景:研究表明,外泌体是干细胞治疗心肌梗死的重要作用机制,低氧预处理对人脐带间充质干细胞外泌体的量和内容物都有所影响。目的:比较常氧和低氧预处理人脐带间充质干细胞源性外泌体对大鼠心肌梗死后心肌损伤修复的影响及可能机制。方法:①从健康新生儿脐带中分离出人脐带间充质干细胞培养至第4代,待50%-60%融合时,更换为无血清培养基,分别置于传统培养箱和低氧孵箱培养48 h,采用超速离心法从两组细胞培养上清中提取外泌体;②SD雌性大鼠(购于山西医科大学实验动物中心)50只,其中40只建立心肌梗死模型,10只进行假手术处理。从造模成功大鼠中取30只随机分为3组:模型对照组、低氧外泌体组、常氧外泌体组,每组10只。心肌梗死术后1周,再次打开心脏,在变白区即梗死区周边四点注射相同体积外泌体或PBS,每点体积25μL,每只100μL。移植后1周,行超声心动图检测,然后取心脏标本进行苏木精-伊红染色和Masson染色,Western blot检测凋亡相关蛋白Cleaved-caspase 3和Bcl-2的表达。结果与结论:①移植后1周,与模型对照组相比,低氧外泌体组和常氧外泌体组左室射血分数、短轴缩短率明显增加(P <0.01),左室舒张末期内径、左室收缩末期内径显著减小(P <0.01),其中低氧外泌体组上述指标改善最显著(P<0.01);②苏木精-伊红染色结果显示,假手术组细胞排列整齐,模型对照组病变程度最严重,低氧外泌体组病变程度轻于常氧外泌体组;③Masson染色结果显示,低氧外泌体组和常氧外泌体组的胶原容积分数低于模型对照组,以低氧外泌体组减少最为明显(P <0.01);④Western blot结果显示,与模型对照组相比,低氧外泌体组和常氧外泌体组心肌组织凋亡相关蛋白Cleaved-caspase 3的表达减少,Bcl-2的表达增加,均以低氧外泌体组改变最为明显(P <0.01);⑤以上结果表明,人脐带间充质干细胞经低氧预处理后,其源性外泌体明显促进了SD大鼠心肌梗死后心肌损伤的修复。

氨法提取鱼油工艺的研究

目的 建立氨法提取鱼油新工艺。克服传统稀碱水解工艺提取鱼油废水中钠盐含量高的问题,达到废弃物综合利用的目的。方法 根据传统稀碱水解工艺的提取原理,用氨水和铵盐代替传统稀碱水解工艺中的氢氧化钠和氯化钠,废水废渣可用作高效绿色肥料。结果 以氨水和铵盐代替传统稀碱水解工艺中的氢氧化钠和氯化钠,鱼油提取率、质量均保持稳定,废水废渣可作为高效绿色肥料的原料进一步利用。结论 建立了氨法提取鱼油新工艺,达到废弃物综合利用的目的。

综合法提取鱼油中多烯脂肪酸的研究

目的用综合法提取鱼油中多烯脂肪酸。方法盐析法、低温冷冻法、尿素包合法等方法的综合应用。结果用综合法提取出来的多烯脂肪酸各项指标符合标准 ,EPA、DHA含量高 ,工业上有推广前景。结论提出五条不同档次的推荐工艺 ,适应我国水产业的现状。

钾法提取鱼油工艺的研究

目的 克服传统淡碱水解工艺提取鱼油废水中钠盐含量高的问题 ,达到废弃物综合利用的目的。方法 根据传统淡碱水解工艺的提取原理 ,用氢氧化钾和硝酸钾代替传统淡碱水解工艺中的氢氧化钠和氯化钠 ,废水废渣可用作高效绿色肥料。结果 以氢氧化钾和硝酸钾代替传统淡碱水解工艺中的氢氧化钠和氯化钠 ,鱼油提取率、质量均保持稳定 ,废水废渣可作为高效绿色肥料的原料进一步利用。