BMP9下调HIF-1α抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞的有氧糖酵解和迁移侵袭

目的研究骨形成蛋白BMP9对三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞有氧糖酵解和迁移侵袭的调控作用。方法实验组使用人BMP9重组腺病毒(AdBMP9)感染MDA-MB-231细胞,对照组用空载的GFP腺病毒感染细胞。采用乳酸、葡萄糖和ATP检测试剂盒检测细胞的葡萄糖摄取量、乳酸和ATP生成量;通过GEPIA2数据库,分析BMP9在泛癌中与糖酵解关键酶基因的相关性;qRT-PCR检测过表达BMP9后,MDA-MB-231中糖酵解关键酶GLUT1、HK2、PKM2、LDHA的mRNA表达水平;STRING数据库分析BMP9抑制MDA-MB-231有氧糖酵解潜在靶点;Western blot检测细胞HIF-1α和下游蛋白表达水平;划痕实验和Transwell实验评估不同处理后,细胞的迁移与侵袭能力的改变。结果与对照组相比,BMP9下调乳腺癌MDA-MB-231细胞的葡萄糖摄取、乳酸生成及ATP水平(P<0.01),抑制HIF-1α及其下游蛋白表达;Rescue实验中,过表达HIF-1α能逆转BMP9对MDA-MB-231细胞有氧糖酵解和迁移侵袭的抑制作用。结论BMP9下调HIF-1α抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231有氧糖酵解和迁移侵袭能力。

SNHG3介导的自噬促进乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭

目的探讨LncRNA SNHG3调控自噬对人乳腺癌细胞MCF-7增殖、迁移、侵袭及EMT的影响。方法使用生物信息学方法及实时荧光定量PCR(RT-qPCR)分析SNHG3在乳腺癌及乳腺癌细胞MCF-7中的表达;采用RNAi技术构建敲低SNHG3(siSNHG3)及对照(siNC)的MCF-7重组细胞株,Western blot及细胞免疫荧光检测自噬标志;使用自噬体-溶酶体融合抑制剂BafA1或早期自噬体形成抑制剂3-MA处理敲低或不敲低SNHG3的MCF-7细胞,Western blot检测LC3-Ⅱ或p62表达,观察对自噬囊泡形成或自噬降解的影响;克隆形成实验、CCK-8实验、划痕愈合实验及Transwell实验检测siSNHG3联合或不联合BafA1或3-MA对MCF-7细胞增殖、横向迁移、纵向迁移及侵袭的影响,Western blot检测其对MCF-7细胞EMT的影响。结果生物信息学分析及RT-qPCR证实,SNHG3在乳腺癌及乳腺癌细胞MCF-7中高表达;Western blot及细胞免疫荧光证实,敲低SNHG3可激活乳腺癌的自噬;克隆形成、CCK-8、划痕愈合及Transwell实验证实,下调SNHG3表达可通过激活自噬抑制肿瘤的增殖、迁移和侵袭;Western blot证实,SNHG3通过负调控自噬促进乳腺癌的EMT进程。结论SNHG3在乳腺癌中异常高表达并负调控自噬,并可通过负调控自噬增强乳腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭和EMT过程,提示SNHG3是乳腺癌诊断和治疗的潜在靶点。

miR-619-5p对乳腺癌细胞增殖、迁移与侵袭的影响

目的探究miR-619-5p在人乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7增殖、迁移和侵袭中的作用及机制。方法乳腺癌和正常乳腺组织及细胞中miR-619-5p的表达利用生物信息学分析或经qRT-PCR法检测;分别转染miR-619-5p模拟物或抑制剂后,qRT-PCR法测定miR-619-5p、上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关分子mRNA的表达;CCK-8法用于检测细胞增殖;划痕愈合实验和Transwell TM实验观察细胞迁移和侵袭能力转变;EMT相关分子的蛋白表达由Western blot检测。生物信息学预测miR-619-5p靶基因,并对潜在靶基因CREB1作初步分析。结果miR-619-5p在乳腺癌中低表达。与对照组相比,过表达miR-619-5p后,miR-619-5p表达水平上调,EMT上皮标志物表达上调,促EMT分子及间质标志物表达下调,细胞的增殖、迁移与侵袭能力削弱,CREB1表达下调;低表达miR-619-5p组结果与上述结果相反。结论乳腺癌组织及细胞中miR-619-5p表达更低,miR-619-5p可抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭和EMT,其效应可能通过靶向CREB1实现。

ICAT诱导巨噬细胞M2型极化促进宫颈癌HeLa细胞迁移及侵袭的体外研究

目的:探讨β-连环蛋白/T细胞因子抑制子(ICAT)是否影响巨噬细胞极化,分析极化后的巨噬细胞对宫颈癌细胞迁移及侵袭的作用。方法:使用生物信息学方法分析ICAT在宫颈癌中的表达情况及其与巨噬细胞的相关性;采用RNAi技术构建沉默ICAT表达的HeLa/si-ICAT及对照HeLa/si-NC重组细胞株;qRT-PCR及Western blot检测重组HeLa细胞中IL-10、TGF-β表达;收集重组HeLa细胞条件培养基(CM)分别处理巨噬细胞后,qRT-PCR及Western blot检测巨噬细胞表型变化;细胞划痕及Transwell试验评价极化后的巨噬细胞对HeLa细胞迁移及侵袭能力的影响。结果:生物信息学分析显示ICAT在宫颈癌组织中的表达显著高于正常宫颈组织,且与M2型巨噬细胞的数量呈正相关(P=0.002);与HeLa/si-NC对照组相比,HeLa/si-ICAT细胞中IL-10、TGF-β表达降低;经HeLa/si-ICAT细胞CM处理后巨噬细胞M2型巨噬标志物Arg-1(P=1.82×10^(−4))、TGF-β(P=0.0094)、MR(P=0.014)表达降低,M1型巨噬标志物iNOS表达升高(P=8.62×10^(−4)),并能显著减弱HeLa细胞的迁移及侵袭能力。结论:HeLa细胞中异常高表达的ICAT可诱导巨噬细胞向M2型极化,极化后的巨噬细胞促进HeLa细胞迁移及侵袭。

c-Myc靶向LncRNA SNHG3对乳腺癌细胞生物学作用的影响

目的:探讨c-Myc靶向LncRNA SNHG3对乳腺癌细胞的生物学作用。方法:通过实时定量PCR(RT-qPCR)法分析c-Myc和LncRNA SNHG3在乳腺癌细胞中的表达情况;生物信息学分析c-Myc与LncRNA SNHG3的调控关系;采用染色质免疫沉淀实验(ChIP)和双荧光素酶报告基因实验验证它们的相互作用,并通过对c-Myc进行RNAi和过表达后,RT-qPCR和Western blot法检测SNHG3的表达变化;CCK8、划痕愈合和Transwell^(TM)实验分别检测细胞的增殖能力、横向迁移能力和纵向迁移及侵袭能力;采用流式细胞术检测细胞的周期分布;RT-qPCR和Western blot法检测上皮型钙黏蛋白(E-cadherin)、基质金属蛋白酶2(MMP2)、波形蛋白(Vimentin)、锌指转录因子(Snail)、细胞周期蛋白D1(cyclinD1)的mRNA和蛋白表达水平。结果:c-Myc和LncRNA SNHG3在乳腺癌细胞中异常高表达(P<0.001);生物信息学发现LncRNA SNHG3是c-Myc转录调控的主要靶标,且c-Myc在LncRNA SNHG3启动子区存在多个结合位点;LncRNA SNHG3与Myc信号通路成正相关(P<0.001)。实验结果证实c-Myc结合LncRNA SNHG3启动子,促进LncRNA SNHG3转录和表达(P<0.001);此外,功能挽救实验结果显示c-Myc靶向LncRNA SNHG3增加MDA-MB-231细胞的增殖数目,迁移与侵袭的穿膜数量(P<0.001)。RT-qPCR和Western blot结果显示过表达LncRNA SNHG3部分可抵消敲低c-Myc表达对细胞的EMT进程;并下调E-cadherin的表达(P<0.01),上调MMP2(P<0.01)、Vimentin(P<0.05)和Snail(P<0.05)的表达。干扰LncRNA SNHG3表达能将细胞周期阻滞在G_(0)/G_(1)期(P<0.001),cyclinD1表达减少(P<0.001)。结论:由c-Myc激活转录的LncRNA SNHG3一方面通过激活上皮间充质转化(EMT)促进乳腺癌细胞迁移、侵袭;另一方面通过加速G_(1)/S细胞周期进程促进乳腺癌细胞增殖。

UPF1在乳腺癌细胞中的表达与作用的研究

目的:观察UPF1在乳腺癌中的表达,对人乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖、迁移和侵袭的影响,及其可能的作用机制。方法:使用生物信息学方法分析UPF1在乳腺癌组织中的表达及作用,构建UPF1小干扰RNA(siRNA)并转染乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7细胞株,构建外源性的UPF1低表达的重组细胞,通过实时荧光定量PCR法和蛋白质印迹法检测重组细胞中UPF1的表达水平;CCK-8法检测细胞的增殖;划痕愈合实验及Transwell小室法分别检测细胞横向和纵向迁移以及侵袭能力;实时荧光定量PCR法检测基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase,MMP9)以及上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)标志物E-钙黏着蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(vimentin)mRNA表达量的变化;蛋白质印迹法检测MMP2、E-cadherin、Vimentin蛋白表达量的变化。结果:生物信息学分析表明UPF1在乳腺癌肿瘤组织中高表达,与免疫细胞浸润相关,并与抑癌基因表达呈正相关,mRNA水平进一步验证UPF1在乳腺癌细胞中高表达,敲低UPF1后,乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7中UPF1的mRNA和蛋白质表达水平均显著下降(P<0.05,P<0.05),MDA-MB-231和MCF-7细胞的体外增殖能力显著增强(P<0.0001,P<0.05),迁移(P<0.05,P<0.001)与侵袭能力(P<0.01,P<0.01)也显著提升,实时荧光定量PCR、Western blot结果显示UPF1可抑制EMT相关通路。结论:UPF1在乳腺癌中高表达,但是UPF1在乳腺癌中可能起抑癌作用,UPF1可能通过抑制EMT通路抑制乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7细胞的增殖、迁移与侵袭。