地锦草提取物通过miR-106-5p/TLR4信号通路改善非酒精性脂肪性肝炎

研究地锦草(Euphorbia humifusa Willd.)提取物对高脂饲料联合葡聚糖硫酸钠(dextran sodium sulfate,DSS)诱导的非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis,NASH)的改善作用及其干预的分子机制。将SPF级别C57BL/6小鼠雌雄对半随机分为正常对照组,NASH模型组,地锦草提取物低、高剂量组(n=10)。对照组给予正常饮水和食物。模型组和药物组在实验全程的14 d中均给予高脂饲料喂养,在此期间药物组进行灌胃给药,从第8 d开始给予持续饮用2%DSS水7 d。实验结束后杀小鼠,检测小鼠血清中甘油三酯(TG),谷丙转氨酶(ALT)含量;H&E染色法观察小鼠肝组织病理学变化;根据生物信息学及前期研究预测靶向调节TLR4的miRNA;采用RT-qPCR法检测小鼠肝组织中miR-106-5p、Toll样受体4(TLR4)、IL-6及TNF-α基因的相对表达情况;Western blot法分析小鼠肝脏中TLR4、IL-1β蛋白水平表达变化。与正常组相比,模型组小鼠TG、ALT均有升高。H&E染色结果显示肝脏出现明显脂肪变性和炎症反应。RT-qPCR结果显示TLR4和炎性因子(IL-6、TNF-α)表达明显升高,而靶向调节TLR4的miR-106-5p表达降低(P<0.05)。Western blot结果显示模型组肝脏中TLR4、IL-1β蛋白表达水平升高(P<0.05)。经药物干预后,小鼠TG、ALT均有所下降;肝组织中TLR4和炎性因子mRNA相对表达水平达降低,miR-106-5p表达上升;TLR4、IL-1β蛋白表达水平下降(P<0.05)。地锦草提取物可有效改善高脂饲料联合DSS诱导的NASH的炎症情况及脂肪沉积,其机制可能与调控miR-106-5p/TLR4信号通路有关。

木瓜发酵物通过miR-350-3p/TLR4信号通路改善小鼠非酒精性脂肪性肝炎

目的研究木瓜发酵物(CSF)对高脂饲料(HFD)联合葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的小鼠非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的改善作用,探讨木瓜发酵物对非酒精性脂肪性肝炎小鼠miR-350-3p/Toll样受体4(TLR4)信号通路的调控机制。方法采用益生菌发酵皱皮木瓜,应用高脂饲料联合葡聚糖硫酸钠诱导小鼠非酒精性脂肪性肝炎模型。将SPF级雄性昆明小鼠随机分为正常组、模型组及木瓜发酵物低、高剂量组,每组10只。灌胃给药,每天1次,连续20 d。其间,正常组给予正常饲料,模型组和木瓜发酵物组均给予高脂饲料,模型组及木瓜发酵物组在最后5 d连续给予2.5%葡聚糖硫酸钠。计算小鼠肝指数;检测小鼠血清甘油三酯(TG)、胆固醇(CHO)含量;HE染色法观察小鼠肝脏组织病理学变化;采用RT-qPCR法检测小鼠肝脏组织中miR-350-3p、TLR4、白细胞介素6(IL-6)及肿瘤坏死因子α(TNF-α)表达情况;Western Blot法分析小鼠肝脏中TLR4、TNF-α蛋白表达情况。结果与正常组比较,模型组小鼠肝指数、甘油三酯和胆固醇均有升高(P<0.05),HE染色结果显示肝脏出现明显脂肪变性和炎症反应,RT-qPCR结果显示TLR4和炎性因子(IL-6、TNF-α)表达明显升高(P<0.05),而miR-350-3p表达降低(P<0.05);与模型组比较,木瓜发酵物可使小鼠肝指数、肝脏甘油三酯和胆固醇明显降低(P<0.05),TLR4和炎性因子(IL-6、TNF-α)表达降低(P<0.05),而miR-350-3p表达升高(P<0.05)。结论木瓜发酵物可有效改善高脂饲料联合葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠非酒精性脂肪肝炎的炎症反应,其机制可能与调控miR-350-3p/TLR4信号通路有关。

基于miR-124-3p/IL-6信号通路的槲皮素和表儿茶素协同调节炎症相关性结直肠癌研究

目的基于miR-124-3p/白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)信号通路探究槲皮素与表儿茶素协同作用对炎症相关性结肠癌模型小鼠的干预作用及作用机制。方法采用氧化偶氮甲烷(azoxymethane,AOM)/葡聚糖硫酸钠(dextran sodium sulfate,DSS)诱导小鼠建立炎症相关性结肠癌模型,同时单独或联合给予槲皮素和表儿茶素,待整个造模周期结束,测量各组小鼠结直肠长度,统计结直肠组织肿瘤数量;采用苏木素-伊红(HE)染色观察各组小鼠结肠组织病理变化;采用qRT-PCR检测结直肠组织中炎症相关基因[Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)、IL-1β、IL-6、IL-17]及肿瘤相关基因[c-myc、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)]和miR-124-3p的mRNA表达;采用Western blotting检测结直肠组织中磷酸化信号转导与转录活化因子3(phosphorylated signal transducer and activator of transcription 3,p-STAT3)和IL-6蛋白表达。结果与对照组比较,模型组小鼠结直肠肿瘤浸润数量增加(P<0.001),结直肠组织病理形态发生改变;结直肠组织中TLR4、IL-1β、IL-6、IL-17、c-myc和VEGF mRNA表达水平明显升高(P<0.05),IL-6和p-STAT3蛋白表达水平明显升高(P<0.01)。与模型组比较,给药组结直肠肿瘤浸润数量减少(P<0.01、0.001),结直肠组织病理形态明显得到改善,且联合给药组作用优于单独给药组;结直肠组织中TLR4、IL-1β、IL-6、IL-17、c-myc和VEGF mRNA表达水平明显降低(P<0.05、0.01),IL-6和p-STAT3蛋白表达水平明显降低(P<0.05、0.01)。通过生物信息学预测发现miR-124-3p可靶向IL-6的3’-UTR序列,与对照组比较,模型组miR-124-3p表达降低(P<0.05);与模型组比较,各给药组miR-124-3p表达升高(P<0.05)。结论槲皮素联合表儿茶素通过miR-124-3p/IL-6的信号通路调节炎症反应,从而抑制结直肠癌。

淋球菌MlaA重组蛋白表达及多克隆抗体的制备与应用

目的 原核表达、纯化淋球菌MlaA蛋白,制备并鉴定其多克隆抗体。方法 构建原核表达载体pET-28a-MlaA,转化BL21(DE3)大肠埃希菌,经IPTG诱导重组蛋白的表达。通过亲和层析法纯化目的蛋白,并进行Western blot鉴定。以纯化的重组蛋白作为抗原,与佐剂乳化后免疫6周龄雌性BALB/c小鼠,3次免疫后取小鼠静脉血并分离血清,采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定抗体效价,用Western blot、间接免疫荧光试验(IFA)和流式细胞术(FCM)检测MlaA多克隆抗体的反应性和特异性。结果 Western blot显示,pET-28a-MlaA转化BL21后表达相对分子质量为35×10^(3)的淋球菌MlaA重组蛋白。ELISA检测MlaA免疫小鼠血清抗体效价为1∶8 000~1∶32 000。Western blot、IFA和流式细胞术检测制备的抗体能识别淋球菌变性和非变性MlaA蛋白。结论 成功表达并纯化淋球菌MlaA重组蛋白,免疫小鼠制备多克隆抗体,将制备的抗体血清作为一抗对淋球菌及其他不同类菌株进行Western Blot检测后发现,制备的多克隆抗体可以特异性识别淋球菌中的MlaA蛋白。经IFA及FCM检测,结果均表明制备的多克隆抗体与淋球菌MlaA有良好的反应性。

分子伴侣对白喉毒素无毒突变体CRM197重组蛋白在大肠杆菌中可溶性表达的促进作用

为了获得有活性的白喉毒素突变体蛋白(Cross-reactingmaterial197,CRM197),本研究利用分子伴侣pG-KJE8与重组质粒pET28a-CRM197在大肠杆菌原核表达系统中进行共表达,来促进目的蛋白的正确折叠,进而提高CRM197蛋白的可溶性表达。将质粒转化至大肠杆菌后并诱导其表达目的蛋白,再通过SDS-PAGE胶染色、Western blotting等技术对所得蛋白进行检测分析。结果发现:利用体外重组技术成功得到了pET28a-CRM197重组蛋白原核表达质粒,且CRM197重组蛋白在原核表达系统中主要以包涵体形式表达;通过探索和优化,确定了诱导蛋白的最佳浓度和温度,当加入终浓度为1.0 mmol/L IPTG、0.5 mg/mL L-阿拉伯糖、5.0 ng/mL四环素,在20℃条件下诱导16h时,目的蛋白的可溶性表达得到显著提高;可溶性表达的CRM197重组蛋白可以与CRM197一抗发生特异性结合,免疫反应性良好。因此,研究发现分子伴侣pG-KJE8可以促进CRM197重组蛋白在大肠杆菌中以可溶性形式表达,且能很好地与CRM197一抗发生特异性结合,证实CRM197重组蛋白具有良好的免疫反应性,为CRM197蛋白的工业化生产及应用奠定了一定的基础。

广东省1036家医疗机构性病实验室梅毒血清学检测能力验证结果

目的调查评估广东省不同医疗机构性病实验室梅毒血清学检测能力,为提高全省性病实验室梅毒检测水平提供依据。方法统一制备发放梅毒血清样本,包括梅毒非特异性血清和梅毒特异性血清,各级别性病实验室按要求分别进行梅毒非特异性血清学定性/定量和梅毒特异性血清学定性试验,通过省性病实验室管理信息系统上报结果,试验结果与靶值一致为正确。结果2021年,全省1036家实验室参加本次能力验证,1031家回报结果,其中33家回报部分结果,平均94.55分,合格率97.39%(972/998)。3种梅毒血清学检测中,梅毒非特异性定性和定量试验平均分分别为93.98分和90.97分,梅毒特异性定性平均分为98.33分。总得分位于全省平均分以上实验室占73.35%(732/998),不合格占2.61%(26/998)。规范化性病实验室成绩平均分(96.52分)和合格率(99.07%)均显著高于普通实验室的92.25分和95.43%。结论我省梅毒血清学检测能力处于较高水平,但不同医疗机构和实验室检测能力具有一定差异,普通实验室梅毒血清学检测能力有待加强,加强性病实验室规范化建设可促进梅毒实验室检测水平的提高。