胚胎干细胞诱生的胰岛素分泌细胞移植对糖尿病鼠的治疗作用

目的:探讨小鼠胚胎干细胞ES-D3诱导生成的胰岛素分泌细胞(IPCs)皮下移植对糖尿病(DM)模型小鼠的血糖及一般状况的影响. 方法:首先,将ES-D3细胞培养于经处理的鼠胚成纤维细胞滋养层上保持未分化状态扩增,对数生长期时转入无血清含bFGF的DMEM诱导培养液使其进行分化;其次,采用STZ(剂量:200 mg/kg)一次性腹腔注射.Balb/c小鼠制备DM模型;最后,将诱导21 d的IPCs行肩胛部皮下移植给DM小鼠,观察小鼠血糖及一般状况的变化. 结果:ES-D3诱导生成的IPCs在培养基中自我组装形成三维立体细胞簇,可被DTZ染成洋红色.诱导生成的IPCs经两次移植给DM小鼠后5 d,受鼠的血糖水平显著降低,一般状况有所改善,但小鼠的血糖未能降至正常水平;第2 次移植后15 d,血糖水平反弹到与移植前没有差别。结论:ES-D3诱导生成的IPCs皮下移植给DM小鼠,能在一段时间内显著降低受鼠的血糖水平,改善一般状况,对DM小鼠起到一定的治疗作用.

胚胎干细胞分化为胰岛素分泌细胞的诱导条件

目的:探索胚胎干细胞ES-D3分化为胰岛素分泌细胞的诱导条件。方法:ES-D3细胞培养于鼠胚成纤维细胞滋养层上,对数生长期时转入无血清含bFGF的DMEM液中,隔天换液,2周后,用DTZ染色、ELISA、免疫细胞化学染色等方法鉴定诱导生成的胰岛素分泌细胞及其所分泌的胰岛素。结果:ES-D3细胞在不含白血病抑制因子和滋养细胞的无血清培养体系中呈悬浮生长,并于第4天形成拟胚体,加入促分化因子bFGF可使胚胎干细胞向胰岛素分泌细胞分化,诱导生成的胰岛素分泌细胞在培养基中自我组装形成三维立体细胞簇。诱导第17天,DTZ染色发现大量被染成暗红色的胰岛素分泌细胞,免疫细胞化学染色亦证实了胰岛素分泌细胞的存在;同时,用ELISA法检测到胰岛素分泌。随着诱导天数增加,DTZ染色阳性细胞数及胰岛素含量均增加。结论:胚胎干细胞ES-D3在无血清含bFGF培养基中能被诱导分化为胰岛素分泌细胞,且该细胞能够分泌胰岛素。

胚胎干细胞诱生的胰岛素分泌细胞分泌胰岛素的研究

目的:研究小鼠胚胎干细胞ES-D3诱生的胰岛素分泌细胞(IPCs)分泌胰岛素的能力及其所分泌的胰岛素的活性. 方法:将ES-D3细胞培养于经处理的鼠胚成纤维细胞滋养层上保持未分化状态扩增,对数生长期时转入无血清含bFGF 的DMEM液进行诱导,隔天换液,21 d后,采用DTZ 染色、免疫细胞化学染色和ELISA等方法检测胰岛素的生成与分泌情况;用RT-PCR法检测PDX-1、Insulin1、Insulin2和Glut2等胰岛素分泌细胞相关基因mRNA的表达,并通过动物实验研究生成的IPCs所分泌的胰岛素的降糖活性. 结果:在诱导21 d,DTZ染色法观察到被DTZ染成洋红色的IPCs;免疫细胞化学染色法显示诱导体系中有胰岛素特异性免疫反应阳性的细胞群;ELISA法测定结果表明IPCs受高糖刺激后分泌胰岛素,动物实验证明所分泌的胰岛素具有降糖活性;RT-PCR法检测到有Insulin2和PDX-1 mRNA 的表达,Insulin 1呈弱表达,Glut2不表达. 结论:小鼠胚胎干细胞ES-D3诱生的IPCs能够合成并分泌胰岛素,而且分泌的胰岛素具有降糖活性.

PBL教学法在研究生干细胞课程教学中的应用

在研究生教学中应用有课程特色的PBL教学法是拓展其应用的新思路。根据干细胞课程的特点,探索尝试与干细胞课程相适应的、多样化有课程特色的PBL教学法并加以实施,一定程度上克服了传统教学方法的弊端,对于提高研究生科研素质及创新能力起到积极的作用。

ES细胞-D_3诱生的胰岛素分泌细胞及其分泌的胰岛素降糖活性的研究

目的:探讨ES细胞-D3来源的胰岛素分泌细胞(IPCs)分泌的胰岛素的降糖活性及IPCs移植对糖尿病(DM)鼠的降糖作用。方法:ES细胞-D3培养于经处理的鼠胚成纤维细胞滋养层上保持未分化状态扩增,对数生长期时转入无血清含bFGF的DMEM诱导液进行诱导分化,使其分化为IPCs。于诱导的第21天,用ELISA法检测IPCs受高糖刺激2h后所分泌的胰岛素,同时将分泌的胰岛素静脉注射给小鼠,观察受鼠血糖的变化;将诱生的IPCs移植给链脲菌素(STZ)诱导的DM小鼠,观察受鼠血糖水平的改变。结果:ES细胞-D3体外诱导生成的IPCs所分泌的胰岛素具有降糖活性,且IPCs经两次移植给DM小鼠后第5天,血糖水平较移植前显著降低(P<0.05),第2次移植后第15天,受鼠血糖水平反弹到与移植前没有差别。结论:小鼠ES细胞-D3诱导生成的IPCs能够分泌有活性的胰岛素,且在一段时间内可显著降低DM受鼠的血糖。

基于团队的研究型教学方法在研究生《干细胞-基础与临床》课程中的应用

目的初步探讨基于团队的研究型教学方法在研究生《干细胞-基础与临床》课程中的应用效果。方法选取中国医学科学院基础医学研究所2014级选修《干细胞-基础与临床》课程的41名研究生作为研究对象,在以传统课堂讲授为基础的学习方法(LBL)上引入基于团队的研究型教学方法进行教学,时间为1学期,采取教学结束后学生对教学效果的评价情况、学生学习满意度及科研创新能力及课题设计水平等进行评估。结果采用基于团队的研究型教学方法取得较好的教学效果,学生求知欲、好奇心和学习兴趣提高,其科研创新能力及课题设计水平也得到提升。结论引入基于团队的研究型教学方法可以有效地提高研究生的原创性思维能力及课题设计水平,是一种有效的教学方法,值得在研究生教学中推广。

无细胞短棒状杆菌纳米级制剂抗肿瘤作用及机理研究

目的 :研究无细胞短棒状杆菌纳米级制剂 (NCPP)体内抗肿瘤作用及机理。方法 :小鼠腹腔注射NCPP与短棒状杆菌制剂 (CPP) 14d后测定脾指数。小鼠腹腔注射艾氏腹水癌细胞 ,于注射癌细胞前 1d及注射后次日起 ,连续 (间隔 1d)腹腔注射NCPP与CPP 5次 ,计算小鼠存活率。小鼠腹腔注射NCPP和CPP 10d后测定腹腔巨噬细胞 (Mφ)吞噬率、吞噬指数、过氧化氢 (H2 O2 )和一氧化氮 (NO)水平、脾脏自然杀伤 (NK)细胞杀伤率及T细胞增殖指数。结果 :NCPP组和CPP组与对照组相比 :均有明显的抑瘤作用 ;脾指数均大于 2 .0 ;腹腔Mφ吞噬率、吞噬指数、产生过氧化氢 (H2 O2 )和一氧化氮 (NO)水平均有显著性提高 (P <0 .0 1) ;脾脏NK细胞杀伤率均有明显提高 (P <0 .0 5 ) ;脾脏T细胞增殖指数均无明显差异。上述所有实验中 ,NCPP和CPP 2组间均无明显差异。结论 :NCPP具有与CPP相同的脾激活及抑瘤作用 ,其机理主要是通过激活Mφ及NK细胞吞噬、杀伤功能所致。

小鼠胚胎干细胞在血管内皮生长因子作用下造血相关基因表达的研究

目的 研究小鼠胚胎干细胞系ES D3在血管内皮生长因子 (VEGF)的作用下表达造血相关基因的情况。方法 先将ES D3形成拟胚体 ,将拟胚体细胞转入含不同浓度VEGF和VEGF +干细胞因子 (SCF)培养基中。分为VEGF 2 0ng/ml组、VEGF 10ng/ml组、VEGF 5ng/ml组、VEGF 5ng/ml+SCF组、VEGF 10ng/ml+SCF组、VEGF 2 0ng/ml+SCF组 ;同时设不加因子的自发分化对照组。采用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)检测各组造血转录因子GATA 2和早期造血细胞阶段表达的基因c kit和 β H1表达 ,并进行定量分析。 结果 经 1周诱导培养 ,各实验组均可检测GATA 2表达 ,其中VEGF 2 0ng/ml组和VEGF +SCF组表达较强。未分化胚胎干细胞不表达c kit和 β H1mRNA ,拟胚体细胞开始表达c kit,实验组以VEGF 10ng/ml+SCF组和VEGF 2 0ng/ml +SCF组表达最强。VEGF 10ng/ml组和VEGF 5ng/ml组 ,β H1的表达分别为阴性和弱阳性 ,其他各组可检测到阳性条带 ,以VEGF 10ng/ml +SCF组表达最强 ;而自发分化组未检测到上述mRNA的表达。结论 对造血转录因子和早期造血细胞阶段表达基因的检测可进一步证实胚胎干细胞的成血分化 ,VEGF或VEGF

混合脐血移植的实验研究

为探讨混合脐血移植重建免疫造血系统的可行性 ,扩大脐血移植 (CBT)的应用范围 ,将孕 2 0日的C5 7BL / 6 (H- 2 b)小鼠和 6 15 (H - 2 k)小鼠经剖腹产取出胎盘和胎鼠 ,剪碎后分离出脐血单个核细胞 (MNC) ,将二者各 1× 10 6个 MNC混匀后经尾静脉注入 X线直线加速器致死量照射的 BAL B/ c(H- 2 d)小鼠。1个月后 ,用抗小鼠 H- 2 Db和 H- 2 Kk单克隆本检测受鼠中嵌合体的存在 ;用混合淋巴细胞培养检测特异性的免疫耐受。结果未行MNC移植的对照组小鼠 3周内全部死亡 ;移植组 70 %存活 ,且体内形成稳定的混合嵌合体。体外混合淋巴细胞培养发现 ,受鼠对两个供者均产生了特异的免疫耐受。证明 2份小鼠脐血可在同一个受鼠体内产生混合嵌合体 ,能重建同种异基因小鼠的免疫造血系统而不引起明显的移植物抗宿主反应 (GVHD) ,这一模型可用于研究临床混合脐血移植中遇到的许多问题。

MHC不相合的双份鼠胎血移植后受体鼠混合嵌合体形成(英文)

本室已经建立了MHC不相合单份鼠胎血同种移植的小鼠模型。基于脐血造血干细胞的免疫学特性及临床实践 ,我们认为脐血移植成功的关键除了选择尽可能相合的供者外 ,保证移植细胞的数量更为重要。因此 ,为了提高移植干细胞的数量 ,本研究在前期工作的基础上 ,探讨MHC不相合的双份鼠胎血混合移植的可能性。研究结果表明 ,混合移植组 4 0只受鼠中有 2 6只在 6 0天的观察期内存活下来 ;应用PCR及流式细胞术均检测到受鼠体内有混合嵌合体的形成 ;此外 ,皮肤移植试验也发现受鼠已被诱导形成对供鼠的特异性免疫耐受 ;小肠组织的病理切片显示受鼠仅表现出轻度GVHD。结论 :MHC不相合的双份鼠胎血能够同时植入 ,重建受鼠的免疫与造血系统 ,这为拓宽脐血的临床应用 ,使更多患者能够有机会接受脐血移植做了有益的尝试。

银杏内酯B对神经细胞活性影响的实验研究

目的 研究不同剂量银杏内酯 B对低血清培养体系中神经细胞活性的影响。方法将新生 Wister大鼠大脑皮层神经细胞分别培养在含 10 %小牛血清 (对照组 )、5 %小牛血清 (低血清组 )、5 %小牛血清 +0 .1mg/ L银杏内酯 B(0 .1mg/ L 银杏内酯组 )、5 %小牛血清 +1mg/ L 银杏内酯 B(1mg/ L 银杏内酯组 )、5 %小牛血清 +10 m g/ L银杏内酯 B(10 m g/ L银杏内酯组 )、5 %小牛血清 +40 m g/ L银杏内酯 B(4 0 mg/ L银杏内酯组 )、5 %小牛血清 +10 0 m g/ L 银杏内酯 B(10 0 m g/ L 银杏内酯组 )的 DMEM培养液中 ,通过 MTT比色法 ,分别检测各组神经细胞的活性。结果 培养第 2、5、8天与对照组比较 ,低血清组、0 .1m g/ L 和 1mg/ L 银杏内酯组神经细胞活性均明显下降 ;与低血清组比较 ,0 .1m g/ L和 1m g/ L银杏内酯组细胞活性均无明显改变 ;而 10 m g/ L、4 0 m g/ L和10 0 mg/ L 银杏内酯组细胞的活性均明显升高。结论 银杏内酯 B在 10～ 10 0 m g/ L 浓度范围内 ,能增强 5 %小牛血清体系中的神经细胞活性。

从亚全能干细胞角度解读远古医学

本文围绕生命科学热点领域干细胞理论研究,以亚全能干细胞视角阐述了对远古医学之精气、阴阳五行学说和经络学说的认知,探索中西医学合璧、干细胞基础与临床研究,开辟疾病现代医疗的新思路。①干细胞与中医万物本原的精气在体内分布及功能上相似;②干细胞分化和自我更新是相辅相成的,处于中医学中的阴阳相济状态;③在体内亚全能干细胞参与五脏六腑组织损伤修复及功能重建,类似于中医阴阳五行学说的互根互生功能;④经络行走于结缔组织间,富集微小血管、淋巴组织网束,穴位在经络上汇集成神经组织区带,与体内功能细胞和组织液共同构建成生物信息网络通路,而亚全能干细胞是经络穴位上重要的效应细胞,循经感传实现机体内物质、能量和生命信息的转换和传递,定向迁移输入健康的干细胞母子以修复和更新病变组织;⑤亚全能干细胞存在于机体各组织发挥重要的免疫调控的调节作用,在病理环境中改善机体免疫调节平衡并促进损伤组织再生修复。

移植物抗宿主病的生物学防治

移植物抗宿主病(GVHD)是导致同种异基因造血干细胞移植患者死亡的一个主要原因,同种异基因GVHD是供者T细胞介导的、针对同种异型抗原的免疫应答。设计有选择性地清除移植物中同种反应T细胞的移植方案,做到既能预防GVHD的发生,又能保留移植物抗白血病作用是移植成败的关键。本文从单克隆抗体治疗、基因治疗和疫苗应用等三个方面综述了当前GVHD生物学防治研究的主要策略。

血管内皮生长因子促进小鼠胚胎干细胞的造血分化

目的:研究血管内皮生长因子(VEGF)体外促进小鼠胚胎干细胞系ES-D3向造血分化的能力。方法:先将ES-D3形成拟胚体,将拟胚体细胞转入含不同浓度的VEGF和VEGF+SCF的培养基中。实验分6组,分别为VEGF 5μg/L组、VEGF 10μg/L组、VEGF 20μg/L组、VEGF 5μg/L+SCF组、VEGF 10μg/L+SCF组、VEGF20μg/L+SCF组,同时设不加因子的自发分化对照组。RT-PCR检测造血转录基因GATA-2和早期造血细胞基因c-k it和β-H1的表达,流式细胞仪检测CD34+细胞,甲基纤维素半固体培养法检测生成造血集落的能力。结果:经过1周的诱导培养,实验组生成的细胞可以表达GATA-2、c-k it和β-H1,CD34+细胞的比例也升高,并可形成造血祖细胞的集落。从诱导生成CD34+细胞的比例和生成的集落数量看,VEGF联合SCF组的诱导效率要高于VEGF单用组和对照组,其中以VEGF 20μg/L+SCF组和VEGF 10μg/L+SCF组的诱导效率最高。结论:VEGF能够促进ESC的早期造血分化,尤以与SCF合用时,其诱导效率更高。

人胚骨髓基质细胞饲养层对人胚胎生殖细胞生长的作用

目的:研究人胚原代骨髓基质细胞(BMSC)饲养层对人胚胎生殖细胞(hEGC)生长的支持作用。方法:以非意愿妊娠流产胎儿股骨为材料制备BMSC饲养层;同时取胎儿组织分离培养人成纤维细胞,以成纤维细胞培养液上清制备条件培养液(CM)。另取13.5d胎鼠制备原代小鼠胎儿成纤维细胞(PMEF)饲养层。分组培养人原始生殖细胞:A组(PMEF饲养层)、B组(BMSC饲养层)、C组(CM)、D组(BMSC饲养层+CM),观察不同条件下hEGC生长增殖行为。结果:D组与A组均有利于支持人胚胎生殖细胞的体外生长,并保持其不分化的状态和多分化的潜能,两组比较无明显差异。单用B组可支持人胚胎生殖细胞的体外生长,但效率低于上述两组。单用条件培养液不能获得贴壁生殖细胞克隆。结论:BMSC饲养层+CM可支持hEGC的体外培养,且无异源性蛋白的污染,更有利于临床应用。

microRNA-373参与调控人脂肪来源间充质干细胞成骨分化

目的用microRNA-373(miR-373)的模拟物转染人脂肪来源Flk1+间充质干细胞(MSC),探讨microRNA-373对Flk1+MSC成骨分化的影响。方法利用脂质体作为载体,用miR-373模拟物瞬时转染Flk1+MSCs,然后对其进行成骨诱导,碱性磷酸酶(ALP)染色和茜素红染色观察成骨情况,real-time PCR技术检测成骨标志性基因的表达。结果 ALP染色和茜素红可见明显差异;real-time PCR检测结果显示,实验组(miR-373组)成骨标志基因runt相关转录因子2(RUNX2)(0.543±0.021)、ALP(0.556±0.024)和骨钙蛋白(OC)(0.499±0.017)的表达都明显低于对照组(NC组)(P<0.05)。结论 miR-373参与调控Flk1+MSC向骨细胞分化。

血管内皮生长因子促进小鼠胚胎干细胞生成CD34^+细胞的研究

目的:研究血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)体外促进小鼠胚胎干细胞系ES-D3生成 CD34+细胞的能力。方法:将ES-D3形成拟胚体,将拟胚体细胞转入含不同浓度的VEGF和VEGF+干细胞因子(stem cell factor,SCF)的培养基中。实验分6组,分别为VEGF 5μg/L组、VEGF 10 μg/L组、VEGF20 μg/L组、VEGF 5 μg/L+SCF组、 VEGF 10 μg/L+SCF组、VEGF 20 μg/L+SCF组,同时设不加因子的自发分化对照组。RT-PCR检测CD34 mRNA的表达,流 式细胞仪检测CD34+细胞的比例,甲基纤维素半固体培养法检测生成造血集落的能力。结果:经过1周的诱导培养,实验组 生成的细胞可以表达CD34 mRNA,CD34+细胞的比例也升高,并可形成造血祖细胞的集落。从CD34 mRNA的表达水平、诱导 生成CD34+细胞的比例和生成的集落数量看,VEGF 20 μg/L+SCF组和VEGF 10 μg/L+SCF组的诱导效率最高。结论: VEGF能够促进ESC生成CD34+细胞,尤以与SCF合用时,其诱导效率更高。

人CD137L在肿瘤细胞的表达及其对肿瘤细胞分泌IL-8的影响

目的 :检测人CD137L在肿瘤细胞的表达及其功能。方法 :采用RT PCR、FACS方法检测人CD137L在肿瘤细胞的表达 ,用ELISA方法检测CD137L对肿瘤细胞分泌IL 8的影响。结果 :9种不同来源的人肿瘤细胞系均不同程度表达CD137L ,其中 ,BEL 74 0 2、HL 6 0、A2细胞系呈高水平表达 ;HepG2 .2 .15、L 78、HT 2 9细胞系中度表达 ;U937、H6、HLE细胞系低表达。胚胎细胞系ECV 30 4中度表达 ,而新分离的正常外周血单个核细胞不表达。CD137L的表达水平与肿瘤细胞系的来源无关 ,同一组织来源的细胞系 ,有的高表达 ,有的低表达。肿瘤细胞上的CD137L对肿瘤细胞本身IL 8的分泌可产生不同的影响 :可使HepG2 .2 .15分泌IL 8的水平增加 ,但对HLE、A2 ,只能微弱地增强肿瘤细胞释放IL 8。结论 :CD137L在肿瘤细胞上的表达是普遍现象 ,其表达可能与细胞的快速生长有关 ;肿瘤细胞的CD137L可增强某些细胞系分泌IL 8。

骨髓Sca-1^+间充质干细胞移植减轻小鼠迟发型超敏反应

目的探讨骨髓Sca-1+间充质干细胞(BMSCs)在迟发型超敏反应(DTH)小鼠中的免疫调控作用。方法 BALB/c小鼠随机分为对照组及MSCs注射组。注射组于0、2及6 d腹腔注射Sca-1+BMSCs,对照组注射0.9%氯化钠注射液。所有小鼠在7和14 d时分别于背部皮下与足跖注射C57BL/6小鼠脾细胞。24 h后用千分尺测量小鼠足跖的肿胀,ELISA法测外周血细胞因子及FACS法测脾脏免疫细胞比例。结果注射组小鼠足跖的肿胀程度[(0.368±0.126)mm]显著轻于对照组[(0.731±0.111)mm,P<0.01]。注射组外周血中IL-10和TGF-β含量显著高于对照组(P<0.05);而IL-12和TNF-α水平显著低于对照组(P<0.05)。注射组小鼠脾脏调节型T细胞和树突细胞的比例均明显高于对照组(P<0.05)。结论 BMSC通过上调抑炎因子和调节型免疫细胞的数量而减轻DTH小鼠的免疫反应。