sTRAIL蛋白原核表达载体的构建、表达及抗肿瘤活性研究

目的:从HL-60细胞中获得了sTrail基因片段,优化蛋白表达条件,并研究其抗肿瘤活性。方法:培养HL-60细胞,提取总RNA,通过RT-PCR扩增sTRAIL蛋白基因片段,并将目的基因克隆至原核表达载体p ET28a上,并电击转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,优化蛋白表达条件,Ni-IDA柱纯化重组蛋白,SDS-PAGE蛋白电泳,胶内酶解质谱鉴定。纯化后的重组蛋白作用HUVEC,He La,Hep-3B,HCT-116,MDA-MB-231,H460细胞检测蛋白生物学作用。结果:DNA测序结果证实成功构建了重组质粒p ET28a-sTrail,SDS-PAGE蛋白电泳,胶内酶解质谱检测显示成功表达sTRAIL蛋白,MTT法和流式细胞术结果显示,sTRAIL蛋白对肿瘤细胞包括He La,HCT-116,MDA-MB-231,H460,Hep-3B细胞有良好的生物活性,对正常的HUVEC细胞无毒性。结论:成功构建可以高效表达sTRAIL蛋白的原核表达载体,优化蛋白的表达和纯化后所得sTRAIL蛋白具有良好的抗肿瘤生物活性,为研究和发展利用sTRAIL蛋白作为临床治疗抗肿瘤药物提供了重要基础。

牛乳铁蛋白肽(LfcinB)在苏云金芽胞杆菌中的融合表达

牛乳铁蛋白肽(bovine lactoferrincin,Lfcin B)来源于牛乳铁蛋白(bovine lactoferrin),是目前已知所有乳铁蛋白肽中活性最高的。前期研究表明,可以通过大肠杆菌表达体系和毕赤酵母表达体系表达有活性的Lfcin B,但得到的产物难以纯化,产量也不理想,所以研究构建新型的Lfcin B表达体系有很重要的意义。苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)能在芽胞形成的同时产生一种δ-内毒素组装成的杀虫晶体,在发酵完成后细胞裂解,将芽胞和晶体释放到培养基中。基于Bt的这种优势,将Lfcin B与分子量为35k Da的Cry60Ba晶体蛋白作融合表达。通过PCR扩增和酶切连接,将Lfcin B基因连接到cry60Ba的下游,构建融合基因并转入无晶体Bt菌株中表达,得到了工程菌4Q7/p PFT60Ba-Lfcin B。利用GYS培养发酵48h,再经过超声破碎、包涵体纯化,SDSPAGE分析表明,工程菌表达了一条38k Da左右的蛋白质条带。将纯化的融合蛋白盐酸水解后进行SDS-PAGE分析,得到近似于3k Da的蛋白质条带,挖取目的条带进行胶内酶解和质谱分析,质谱结果显示,挖取的目的条带样品为Lfcin B蛋白的特异性肽段,说明在酸水解过后,融合蛋白Cry60Ba-Lfcin B中的Cry60Ba和Lfcin B分离开,得到单独的Lfcin B蛋白。由此可见,利用晶体蛋白在苏云金芽胞杆菌中进行融合表达可能作为一种新型有效的Lfcin B的高效表达体系,为采用基因工程的方法大量生产具有活性的牛乳铁蛋白肽Lfcin B蛋白奠定基础。