PCV2b衣壳蛋白C端连接不同B细胞表位对其免疫原性的影响

为了研制廉价高效的猪圆环病毒2型(PCV2)亚单位疫苗,根据大肠杆菌密码子的偏好性合成PCV2b(GenBank:AY969004.1)cap基因全序列,利用PCR技术,分别将PCV2的2个B细胞表位(226LKDPPLNP233和195HVGLGTAF202)以单独和串联的方式连接到Cap的C端,成功构建至pE-SUMO表达载体,将3个重组载体转化表达菌株BL21(DE3)后诱导表达,经SDS-PAGE分析和Western Blotting鉴定,3种重组蛋白均以可溶形式表达且表达正确。对3种重组蛋白分别进行镍柱亲和层析纯化,再用SUMO蛋白酶除去融合标签,获得无标签的Cap-e1、Cap-e2和Cap-e12蛋白,并分别与相应的弗氏佐剂等体积乳化,将20只6周龄大小的雌性Balb/c小鼠随机分成5组,分别免疫3种重组蛋白,同时设置疫苗组和PBS组作为对照组,并进行免疫评价,比较C末端连接的不同B细胞表位对Cap免疫原性的影响。抗体检测结果表明,除第2周外,各试验组的抗体水平均显著高于PBS组,且连接2个表位的Cap-e12蛋白产生的抗体水平高于只连接1个表位的蛋白(Cap-e1、Cap-e2),而在第6周时,Cap-e12蛋白抗体水平与疫苗组无显著差异。综上Cap的免疫原性与连接表位数量有关,连接2个表位后能显著提高Cap的免疫原性。

猪圆环病毒2b型表位嵌合病毒样颗粒在E.coli中的制备及鉴定

为了研究一种更为高效、廉价的猪圆环病毒2型(PCV2)亚单位疫苗,针对PCV2b型Cap基因核酸序列进行优化,将其编码中和表位226LKDPPLNP233的基因序列连接于Cap基因C端(Capc),并插入PE-Sumo载体,借助大肠杆菌表达系统对Capc蛋白进行表达;利用SDS-PAGE、Western blot、动态光散射和透射电镜观察等手段,对纯化后的目的蛋白活性及其形成的结构进行初步鉴定。结果显示,嵌合Capc基因片段成功插入PE-Sumo载体,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中;Sumo-Capc重组蛋白在26℃下诱导12 h能够以可溶形式大量表达;经纯化的Capc蛋白能够与PCV2单克隆抗体特异结合,并能够自组装形成直径约为18 nm的病毒样颗粒。综上,成功构建了能够表达PCV2b型中和表位嵌合Cap的大肠杆菌表达系统,纯化得到的Capc蛋白具有良好的免疫反应性,且能够自组装成病毒样颗粒。