胎猪肾脏发育不同时期相关信号分子的表达

目的:明确不同时期胎猪的肾脏发育情况,并研究胎猪肾脏发育相关信号分子的表达。方法:收集不同时期(妊娠21.5、27.5、35.0、45.0、75.0及110.0 d)胎猪肾脏组织,应用HE法观察不同时期胎猪肾脏的组织结构。通过实时荧光定量PCR和Western blot分别检测肾脏发育相关信号分子(Pax2、Pax8、Six2、Six1、Sall1和Bmp4)的mRNA和蛋白表达水平,并通过免疫组织化学检测Pax2在不同时期胎猪肾脏的表达定位情况。结果:27.5 d胎猪的后肾已经开始发育;35 d早期肾小体已经出现,肾小管也开始发育;45 d观察到近皮质不成熟的肾小体和近髓质成熟的肾小体;75 d肾单位数目显著增加,观察到肾椎体、肾乳头和肾盂;110d肾脏基本发育成熟,皮髓质分界明显,仍有新的肾单位产生。Pax2、Pax8、Six2、Six1、Sall1和Bmp4在胎猪75d的肾脏中mRNA和蛋白表达量高于35 d。Pax2广泛表达于输尿管芽、后肾间充质、帽状间充质、肾小囊体、逗号形体、S形体以及肾小管,并在后肾发育过程中持续表达。结论:27.5 d时胎猪后肾已经开始发育,110 d基本发育成熟。Pax2、Pax8、Six2、Six1、Sall1和Bmp4等信号分子在胎猪肾脏发育过程中均有不同程度表达,其中Pax2可能是胎猪肾脏发育的关键调控分子。

CRISPR/Cas9介导的猪Six1和Six4基因敲除细胞系的建立

目的:利用干细胞囊胚互补技术再生同种或异种动物器官已得到验证,其重要的前提是需要构建出相应的器官缺失动物模型。本文拟通过CRISPR/Cas9基因编辑技术建立猪Six1单基因和Six1/Six4双基因敲除猪细胞系,为构建肾脏发育缺陷和缺失猪模型奠定重要的研究基础。方法:选取猪Six1基因和Six4基因第一外显子为敲除靶点,分别设计并合成单导向RNA(single guide RNA,sg RNA),将其插入含有Cas9骨架的PX330质粒,分别构建Six1基因和Six4基因敲除打靶载体PX330-sg RNA1和PX330-sg RNA4;用T7EN1酶验证打靶载体敲除效率后,将高效打靶载体与含G418抗性的质粒(p CMV-td Tomato)共转染原代猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblasts,PFFs)中,并通过药物筛选获得单克隆细胞群落,随后对单克隆细胞进行基因型鉴定。结果:分别成功构建Six1和Six4基因的Cas9/sg RNA表达载体。转染Six1基因打靶载体经药物筛选后,利用PCR方法鉴定所获得的Six1基因敲除单克隆细胞系48个,其中Six1-/-细胞系21个。通过同样方法同时转染Six1基因和Six4基因打靶载体,经药物筛选后共获得44个单克隆细胞系,其中Six1-/-Six4-/-细胞系为13个。结论:通过CRISPR/Cas9基因编辑技术可高效获得Six1单基因敲除细胞系和Six1/Six4双基因敲除细胞系,为构建肾脏发育缺陷猪动物模型提供了基础,并有助于研究Six1和Six4基因在猪肾脏发育中的功能。

miRNA-205过表达载体的构建及其对猪诱导性多能干细胞建系的作用

目的:构建miRNA-205过表达载体并研究miRNA-205对猪诱导多能干细胞系建立的影响。方法:对本实验室已建系的猪primed胚胎干细胞、猪内细胞团细胞及猪胎儿成纤维细胞三者之间进行miRNA表达谱的分析比较,利用PCR扩增miRNA-205前体序列,并将其克隆于基础表达载体p CAGDNA3-h Fat1,构建过表达载体p CAG-miR205。使用脂质体转染技术将该载体转染到已转基因修饰的猪胎儿成纤维细胞(含有鼠源干细胞多能性转录因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc)。利用干细胞培养液诱导培养建立猪诱导性多能干细胞系。通过实时荧光定量PCR检测转染前后细胞内miRNA-205的表达情况,比较分析miRNA-205对猪诱导性多能干细胞的建系效率的影响。结果:成功构建了p CAG-miR205过表达载体;相较于未转染细胞,转染该载体细胞的miRNA-205表达量显著升高(P<0.01);利用干细胞培养液诱导后培养转染组的诱导性多能干细胞克隆长出率高于未转染细胞组。结论:研究结果表明在细胞水平上过表达micro RNA-205,可提高猪诱导性多能干细胞建系效率;已构建的miRNA-205过表达载体将有助于在后续研究中建立稳定表达miRNA-205的细胞系,为进一步深入研究miRNA-205在干细胞重编程和多能性维持中的作用机制打下基础。

猪naive-like胚胎干细胞向神经细胞体外诱导分化

目的:将猪naive-like胚胎干细胞体外定向诱导分化为神经细胞,为猪多能干细胞诱导神经分化方法的建立提供参考。方法:利用小分子化合物β-巯基乙醇、B-27、肝素等组成的神经诱导培养液,采用直接分化法,分化得到神经样细胞,对其进行神经特异性基因表达鉴定,同时检测分化后的细胞是否已经丧失多能性。结果:分化所得到的神经细胞具有明显的神经细胞结构特征,RT-PCR和免疫荧光结果显示分化后的神经细胞表达多种神经细胞特异性基因,qPCR结果显示分化后多能因子的表达显著降低,神经特异性基因表达显著升高,免疫荧光结果经统计分析后显示,低分子量神经微丝蛋白(light neurofilament protein,NF-L)阳性细胞率可达79%。结论:成功实现了体外直接诱导猪naive-like胚胎干细胞向神经细胞分化,为神经系统疾病修复与治疗研究奠定了基础。

基于CRISPR/Cas9系统制备猪Pax2基因敲除细胞系

肾脏发育缺陷或缺失的猪模型可为人源化肾脏器官在异种动物体内再生提供“发育空位”,因此敲除肾脏发育关键基因Pax2(Paired box2)获得该动物模型是肾脏再生的关键步骤。本文利用生物信息学分析软件比对分析了不同物种间Pax2蛋白结构,明确了猪Pax2蛋白在氨基酸序列、二级结构和三级结构方面与人、小鼠具有相似性。结合Pax2蛋白在人和小鼠肾脏发育中的功能,选择猪Pax2基因第8外显子序列作为打靶目标区间,设计并构建了用于敲除猪Pax2基因的CRISPR/Cas9打靶载体。在检测CRISPR/Cas9载体打靶猪Pax2基因效率的基础上,利用细胞核转染和G418药物筛选获得巴马小型猪细胞单克隆。通过PCR、T载体克隆和Sanger测序检测各细胞单克隆Pax2基因的敲除情况,鉴定出33个双等位基因敲除Pax2基因的巴马小型猪细胞系,敲除效率达到45.21%(33/73)。本研究为肾脏缺失或肾发育不全的猪模型的获得奠定实验基础,同时为后续在猪体内再造人源化肾脏以及肾发育疾病的研究提供了研究材料。

生长因子对猪卵母细胞成熟及孤雌胚胎发育的影响

主要探讨了三种生长因子对猪卵母细胞成熟及孤雌胚胎发育及多能基因表达的影响,结果表明:成熟液中添加生长因子后可显著提高卵母细胞成熟率;成熟液和发育液中都添加生长因子后胚胎卵裂率、囊胚率及胚胎质量均显著升高;添加生长因子可极显著提高孤雌囊胚中多能基因的表达.本研究为提高猪卵母细胞成熟及胚胎早期发育奠定了基础,进而为获得更利于分离培养猪胚胎干细胞系的囊胚材料提供了参考.

心中的太阳

连续的雨天,使我们这干旱的西北土地得到了滋润,而我,不知怎地,好像并不喜欢这天气。雨后的空气,带着平日里很少闻到的青草味,使人心旷神怡。来到公园,放眼望去,透过一层水汽,看到湖天一色,草山一体,再加上一座亭台楼阁,宛如梦中一般。好一个"塞外江南"!