高血压机械力诱导血管平滑肌细胞结构与功能变化及其在血管疾病中的作用

血压升高产生的机械力在血管分化与发育、血管正常结构与功能维持以及血管病变过程中起决定作用,血脂和/或血糖异常升高可协同机械力作用加速血管重构及疾病发生发展。机械力可非特异性激活血管细胞所有跨膜蛋白分子,引起细胞内多信号通道分子(第二效应分子)同步活化。多通道信号分子在信号网络结点分子汇集,继而再散发,启动更多信号通路活化,实现信号的级联瀑布放大,导致细胞一系列病理生理学变化如细胞分化、迁移、炎症、表型变化、钙化、增殖、凋亡等,最终引起血管的结构与功能改变如动脉粥样硬化等,成为心脑血管疾病致死、致残的主要原因。本文对本课题组及国际同行相关研究进展,亦即血压升高产生的机械力对血管平滑肌细胞作用相关的血管重构做一简要综述。

盐酸小檗碱通过抑制PKCα磷酸化抑制机械牵张力诱导的血管平滑肌细胞增殖和凋亡

[目的]观察机械牵张力(SS)是否通过激活PKCα诱导小鼠血管平滑肌细胞(VSMC)增殖和凋亡,并探讨盐酸小檗碱(BBR)对它的作用及机制。[方法]实验共分6组:正常对照组、BBR组、PKCα抑制剂(Go6976)组、SS组、SS+BBR组、SS+Go6976组。静息培养的细胞给予BBR或Go6976预处理1 h,继而予10%强度的SS刺激15 min后收集细胞,Western blot检测PKCα和MAPK(ERK、JNK、p38)磷酸化水平。BBR或Go6976预处理1 h,牵拉时间为1 h,继续培养23 h,免疫荧光法检测细胞增殖(Ki67)和凋亡(TUNEL)。[结果]Western blot与免疫荧光结果显示,与正常对照组相比较,SS可升高PKCα和MAPK(ERK、JNK和p38)磷酸化水平(P<0.05),并增加VSMC的增殖和凋亡水平(P<0.05)。BBR可抑制PKCα和ERK、JNK、p38磷酸化水平(P<0.05),同时抑制VSMC增殖和凋亡(P<0.05);Go6976可抑制PKCα和ERK、JNK磷酸化水平(P<0.05),但对p38磷酸化的增加没有影响,同时抑制VSMC增殖和凋亡(P<0.05)。[结论]BBR通过抑制SS诱导的VSMC的PKCα和MAPK磷酸化,抑制VSMC增殖和凋亡。

三七总皂苷对大鼠血管平滑肌细胞增殖及JNK磷酸化的影响

【目的】研究发现,三七总皂苷(TPNS)具有抑制和促进细胞增殖的双向调节作用,但是具体的作用机制尚不明确。本研究旨在观察TPNS对大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)增殖的影响及经由何种信号通路介导。【方法】采用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法)和蛋白印迹(Western blot)法观察了体外培养的大鼠VSMC在不同浓度及一定浓度不同作用时间TPNS作用下,VSMC增殖活性的变化及c-Jun氨基末端激酶(JNK)磷酸化的变化;并用DAPI染细胞核,观察TPNS作用后核形态的变化。【结果】MTT法观察到:TPNS的浓度为0.5g/L,1.0g/L,1.5g/L时,无论是处于静息状态或50mL/L血清刺激下,VSMC的代谢活性均增高;TPNS的浓度为3.0g/L时,静息培养的VSMC的代谢活性没有明显的变化,而50mL/L血清刺激的VSMC的代谢活性仍增高;TPNS的浓度为6.0g/L,12.0g/L时,静息培养或50mL/L血清刺激下的VSMC的代谢活性均降低,并随着浓度的增大,代谢活性降低越明显。同时,Westernblot结果显示:TPNS能快速的激活JNK1/2,并呈时间和浓度依赖性。当TPNS的浓度为0.5g/L时,即可引起JNK的磷酸化,并随着浓度的增大,磷酸化作用增强;当TPNS的浓度为1.5g/L时,作用5min,JNK呈现最大程度的激活,随后逐渐减弱。DAPI染核观察到,6.0g/LTPNS作用48h后,VSMC出现了核固缩、核碎片等细胞凋亡的特征。【结论】较低浓度的TPNS可促进血管平滑肌细胞的增殖,而较高浓度的TPNS可抑制其增殖,JNK1/2磷酸化可能是引起细胞增殖受到抑制的机制之一。

组织学与胚胎学医学教学模式改革初探

目的目前的医学教育课程体系大致可分为3种类型:以学科为中心的传统课程体系、以问题为中心的课程体系(PBL)以及以器官系统定位的课程体系,但这3种课程体系各具优缺点。本研究将这3种方法合理融为一体,去除各自教学方法的缺陷,保留优点,形成独特的教学新法,使之能更好地适合中国医学教育发展,并易于推广应用。方法本研究涉及5年制、8年制医学本科学生和组织学与胚胎学教研室全体教师。课程改革内容由3部分组成:(1)课程内容精讲;(2)相关进展介绍和(3)科研小组活动。结果学生们可以渐进式、系统地牢固掌握基本知识点(正常的人体组织细胞的结构与功能),同时可以了解16个与临床疾病相关的疾病病因与治疗的研究进展现状,并在导师指导下完成某一领域(系统)的课题研究。结论该法兼顾了3种教学课程体系的优点,不需改动任何原有的教学资源,较好地继承和发扬传统教学方法,符合中国国情,具有切实可行性,可以在国内外推广。

机械牵张力和去甲肾上腺素协同激活小鼠血管平滑肌细胞α_1-肾上腺素能受体-ERK1/2信号促进细胞增殖

目的为证实α1-肾上腺素能受体(α1-AR)是否介导了机械牵张力和/或去甲肾上腺素(NE)对小鼠主动脉血管平滑肌细胞(VSMC)的细胞外信号调节激酶(ERK1/2)的协同激活并加速血管重构。方法静息培养的小鼠血管平滑肌细胞(VSMC)经有或无Prazosin(α1-AR抑制剂)预处理后,给予机械牵张力和/或NE刺激,Western Blotting检测ERK1/2的磷酸化水平,免疫荧光检测ki-67的表达(细胞增殖),RT-PCR检测细胞α1-AR亚型(α1A-,α1B-和α1D-AR)mRNA的表达。分别用三种亚型的α1-AR-siRNA预处理细胞,观察α1-AR各亚型基因沉默对机械牵张力诱导的VSMC ERK1/2磷酸化的影响。结果机械牵张力可分别上调α1B-和α1D-AR mRNA表达,但α1A-AR mRNA未检测到。机械牵张力和/或NE均可激活ERK1/2,引起ERK1/2磷酸化增加,而两种因素共同存在时ERK1/2激活更加明显;ki-67的表达呈现类似效应;这种由机械牵张力和/或NE激活的作用均可被Prazosin部分抑制。α1B-和α1D-AR-siRNA预处理可分别减少α1B-和α1D-AR mRNA的表达,进而相应地导致机械牵张力诱导的ERK1/2磷酸化的抑制。RT-PCR未能检测到经α1A-AR-siRNA预处理后的VSMC表达α1A-AR mRNA,但仍可见机械牵张力诱导的ERK1/2磷酸化被抑制。结论高血压机械牵张力和NE可协同促进VSMC ERK1/2激活及细胞增殖,导致血管重构加速;α1-AR部分介导了这一过程,α1-AR各亚型起着相似作用。本研究可望为深入探讨高血压异常机械力合并交感神经活性亢进协同促进血管重构的致病机制及防治新策略提供实验依据。

骨骼肌组织压片Mallory染色在组织学实验教学中的应用

目的建立一种快速制作肌组织实验样本的方法,探讨Mallory染色的骨骼肌组织压片在组织学实验教学中的应用。方法学生取出小鼠骨骼肌,放置于载玻片上,用另一玻片轻压成薄片,制作成骨骼肌组织压片,经Mallory三色染液快速染色,然后镜下观察拍照。结果骨骼肌组织经施压后可变成薄层组织片,普通光镜下即可观察到明显的横纹结构,Mallory染液可很快使骨骼肌组织压片中的肌纤维染成橘红色,横纹更加明显,而肌纤维之间的结缔组织呈深蓝色。结论骨骼肌组织压片Mallory染色简便、快速,可在20分钟内完成整个实验过程,适合在传统的组织学实验教学中插入此内容,增加学生自己动手做实验的机会,提高了学生主动学习的兴趣,增强学生动手能力,加强对骨骼肌组织结构的更深入地了解,丰富组织学内容,把教学与科研结合起来,达到提高教学质量的目的。

机械牵张力和去甲肾上腺素协同激活小鼠血管平滑肌细胞α_1-肾上腺素能受体-ERK1/2信号促进细胞增殖机械牵张力和去甲肾上腺素协同激活小鼠血管平滑肌细胞α1-肾上腺素能受体-ERK1/2信号促进细胞增殖

目的为证实α1-肾上腺素能受体（α1-AR）是否介导了机械牵张力和/或去甲肾上腺素（NE）对小鼠主动脉血管平滑肌细胞（VSMC）的细胞外信号调节激酶（ERK1/2）的协同激活并加速血管重构。方法静息培养的小鼠血管平滑肌细胞（VSMC）经有或无Prazosin（α1-AR抑制剂）预处理后,给予机械牵张力和/或NE刺激,Western Blotting检测ERK1/2的磷酸化水平,免疫荧光检测ki-67的表达（细胞增殖）,RT-PCR检测细胞α1-AR亚型（α1A-,α1B-和α1D-AR）mRNA的表达。分别用三种亚型的α1-AR-siRNA预处理细胞,观察α1-AR各亚型基因沉默对机械牵张力诱导的VSMC ERK1/2磷酸化的影响。

α1肾上腺素能受体介导去甲肾上腺素和高血压机械力联合信号促进血管重构的机制

目的交感神经系统活性亢进引起的去甲肾上腺素分泌增多与血压升高产生的异常机械力联合作用可加速血管重构，但机制不明。本研究旨在探讨Ot。肾上腺素能受体（α1-AR）是否介导了机械牵张力和去甲肾上腺素（NE）的联合信号加速血管重构。方法将小鼠的下腔静脉移植到颈总动脉构建静脉搭桥模型，术后给予α1-AR抑制剂哌唑嗪（Prazosin），1mg／（kg·d），腹腔注射，或同等量的生理盐水处理2周或4周，观察静脉移植物新生内膜的厚度。

Hoechst33342与DAPI标记细胞核对胞内活性氧检测效果的比较

目的探讨Hoechst 33342与DAPI两种荧光染料标记细胞核后对细胞内活性氧水平的影响。方法静息培养的血管平滑肌细胞加入晚期糖基化终末产物作用10 min,加入标记活性氧的荧光探针H2DCFDA,再分别加入Hoechst 33342和DAPI不同荧光染料进行核标记。荧光显微镜下观察细胞核被标记的数目与细胞内活性氧的荧光水平。结果 Hoechst 33342染料标记5 min后即可见细胞核被标记上,随着时间的延长被标记的核数目并不发生改变;而与之明显不同的是,DAPI染料标记5 min时,只有几个细胞核被标记上,但随着时间的延长被标记的核数目越来越多。Hoechst 33342标记后细胞内活性氧的荧光强度并不随时间的延长发生变化,而DAPI标记后细胞内活性氧绿色荧光的细胞数就越少,DAPI标记的细胞核数与显示活性氧绿色荧光的细胞数呈反比。这些结果提示,DAPI染料在标记细胞核时破坏了活性氧在细胞内的储存,干扰了实验结果。结论检测细胞内活性氧时,应使用Hoechst 33342核标记染料而不能用DAPI。

三七总皂苷对心血管细胞信号转导影响的研究进展

三七总皂苷是中药三七的有效成分,它对于心血管细胞具有多方面的作用。在对心肌作用方面,三七总皂苷可降低不可逆性室颤发生,改善心脏舒缩功能,减少心肌缺血性损伤,对抗心肌肥大,抑制左心室重构;对内皮细胞作用主要表现在引起内皮细胞内游离钙离子浓度的增加,分泌NO1t-PA等,保护内皮;对血管平滑肌细胞,三七总皂苷具有抑制和促进细胞增生的双向作用。本文综述了近年来三七总皂苷对心血管细胞信号转导影响的研究进展。

硝苯地平和氢氯噻嗪对机械牵拉力诱导的小鼠血管平滑肌细胞ERK1/2磷酸化和Ki67表达的影响

目的探讨钙离子阻滞剂硝苯地平和利尿剂氢氯噻嗪对机械牵拉力刺激诱导的血管平滑肌细胞(VSMC)ERK1/2磷酸化和Ki67表达的影响。方法体外培养静息状态下的VSMC,在分别给予硝苯地平和氢氯噻嗪预处理后给予机械牵拉力刺激。用免疫印迹法检测细胞内ERK1/2磷酸化水平;对细胞进行免疫荧光染色,检测Ki67表达水平。结果与阴性对照组相比,硝苯地平或氢氯噻嗪对静息培养的VSMC中ERK1/2磷酸化和Ki67的表达无影响;单纯机械力牵拉刺激,可引起静息培养的VSMC中ERK1/2磷酸化和Ki67的表达明显增加;硝苯地平可呈浓度依赖性抑制机械力牵拉引起的ERK1/2磷酸化和Ki67表达的增加;而氢氯噻嗪与硝苯地平作用相反,可进一步协同增加机械力牵拉引起的上述作用。结论硝苯地平和氢氯噻嗪对机械牵拉力引起的VSMC中ERK1/2磷酸化和Ki67表达增加的作用完全相反,前者可抑制机械牵拉力引起的VSMC中ERK1/2磷酸化和Ki67的表达增加,后者相反,呈协同增加。

辛伐他汀抑制机械牵张力和氧化低密度脂蛋白所致血管平滑肌细胞全基因组甲基化水平的降低

目的探讨小鼠血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)在机械牵张力(stretch stress,SS)和氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,ox LDL)作用下全基因组甲基化水平的变化,并进一步考察辛伐他汀(simvastatin,SIM)对此变化的影响。方法血浆制备氧化型低密度脂蛋白,体外常规培养VSMCs,施加机械牵张力和/或氧化型低密度脂蛋白,或用辛伐他汀预处理1h后再施加刺激,用荧光探针5-甲基胞嘧啶检测VSMCs全基因组甲基化水平。以细胞免疫荧光定量阳性率和SPSS统计软件对甲基化水平进行分析。结果机械牵张力和氧化型低密度脂蛋白均可降低VSMCs的全基因组甲基化水平,且两者联合作用大于单一因素,辛伐他汀预处理VSMCs可部分抑制机械牵张力和/或氧化低密度脂蛋白诱导的全基因组甲基化水平降低。结论机械牵张力和氧化低密度脂蛋白可分别促进VSMCs全基因组甲基化水平降低,当两者共处理时呈相加作用,辛伐他汀可部分抑制上述效应。

小脑组织压片快速制作在组织学实验教学中的应用

目的在组织学的实验教学中开展小脑组织压片快速制作,增加学生的实践机会,提高他们的动手能力。方法学生先将小脑薄片用甲苯胺蓝分别染色4min和8min,并用拇指用力按压盖玻片,使小脑组织变薄,然后镜下观察。结果发现染色后4min小脑组织呈现淡蓝色,浦肯野细胞轮廓较清楚。在染色后8min,浦肯野细胞被染成深蓝色,轮廓清楚,达到了最佳效果。结论学生通过应用小脑组织压片快速制作技术,可增强动手能力,并很好地了解小脑组织中浦肯野细胞的形态和分布,把教学、科研连接在一起,达到提高实验教学质量的目的。

糖基化终产物受体介导高血压机械牵张力协同促进糖基化终产物激活小鼠血管平滑肌细胞ERK1/2加速血管重构

目的为证实糖基化终产物受体(RAGE)是否介导了机械牵张力和/或糖基化终产物(AGE)对小鼠主动脉血管平滑肌细胞(VSMC)的细胞外信号调节激酶(ERK1/2)的协同激活并加速血管重构。方法①正常血糖小鼠下腔静脉分别连接到正常血糖小鼠和STZ诱导的糖尿病小鼠右颈总动脉形成"静脉桥",术后不同时间点(0、4、8周)收获移植静脉作常规切片HE染色,观察移植静脉在动脉压力作用下的血管构筑情况。②体外静息培养的血管平滑肌细胞分别给予机械牵张力和/或糖基化终产物刺激,用Western Blotting法检测细胞内ERK1/2磷酸化水平。③糖基化终产物受体基因沉默(siRNA-RAGE)或过表达(overexpression-RAGE)预处理VSMC后给予机械牵张力和/或糖基化终产物刺激,观察ERK1/2活性的变化。结果高血压(动脉压)可明显改变移植静脉的血管构筑,但移植到高血糖组的比正常血糖组的血管构筑改变更加明显(术后4周和术后8周高血糖组与正常血糖组移植血管厚度分别为73.99±4.45μm比49.67±11.62μm和117.06±17.62μm比88.97±15.78μm,P均<0.05)。机械牵张力和糖基化终产物单独或共存时均可引起细胞内ERK1/2磷酸化增加,但两者共存时激活效应最明显;而ERK1/2的激活信号可通过糖基化终产物受体基因沉默或过表达被抑制或增强。结论高血压机械牵张力和糖基化终产物可协同促进VSMC ERK1/2激活,导致血管重构加速,糖基化终产物受体部分介导了这一过程。本研究可为深入探讨高血压机械力协同糖尿病AGE促进血管重构的分子机制及防治新策略提供实验依据。

颈总动脉压诱导的小鼠移植静脉血管重构

【目的】研究血压升高引起血管重构的机制。【方法】手术取出麻醉后的11～12周供体C57BL/6J小鼠的下腔静脉,连接到同窝出生的受体小鼠颈总动脉,构建"静脉桥"。继而,收获受颈总动脉压作用不同时间(0,2,4,8周)后的移植静脉,经石蜡包埋HE染色、丽春红-维多利亚蓝染色以及平滑肌特异性抗体免疫组化染色后观察其血管构筑。【结果】术后各时间点均可见移植静脉血管壁增厚及新生内膜的形成,呈时间依赖性。与正常静脉[(11.10±0.9)μm)]相比,术后8周血管壁[(88.97±16)μm)]增厚了8倍(P<0.01)。术后2周移植静脉新生内膜中即可见血管平滑肌细胞大量增生,4周最多,8周后数量减少,但细胞外基质明显增多。移植静脉在动脉压作用下,其弹性膜历经了断裂、合成和重建过程。【结论】血压升高产生的机械力可直接导诱导移植的小鼠静脉粥样硬化以及弹力膜的重构。本研究可望为深一步探索高血压引起血管重构的机制及防治新策略提供有用的动物模型及实验依据。

Hoechst33342与DAPI标记细胞核对细胞内活性氧检测的影响比较

目的探讨Hoechst33342与DAPI两种荧光染料标记细胞核后对细胞内活性氧水平的影响。方法静息培养的血管平滑肌细胞加入晚期糖基化终末产物作用10min，加入标记活性氧的荧光探针H2DCFDA，再分别加入Hoechst33342和DAPI两种荧光染料进行核标记。荧光显微镜下观察细胞核被标记的数目与其细胞内活性氧的荧光水平，比较两种染料标记细胞核后细胞内活性氧的荧光强度。结果Hoechst33342染料标记5min后即可见细胞核被标记上，并且随着时间延长被标记的核数目并不发生改变；而与之明显不同的是，DAPI染料标记5min时，只有几个细胞核被标记上，但随着时间的延长，被标记的核数目越来越多。Hoechst33342标记后细胞内活性氧的荧光强度并不随时间延长发生变化，而DAPI标记随时间延长，被标记的细胞核数目越多，显示活性氧绿色荧光的细胞数就越少，DAPI标记的细胞核数与显示活性氧绿色荧光的细胞数呈反比。这些结果提示，DAPI染料在标记细胞核时破坏了活性氧在细胞内的储存，干扰了实验结果。结论检测细胞内活性氧时，应使用Hoechst33342核标记染料而不能用DAPI核标记染料。[作者简介]周玉环，硕士研究生，研究方向为血管重构的分子机制与防治。

辛伐他汀抑制机械牵张力介导的巨噬细胞活性氧族元素的表达

目的探讨机械牵张力刺激能否介导小鼠巨噬细胞活性氧族元素(ROS)的产生,并进一步探讨辛伐他汀对此作用的影响及其作用机制。方法体外常规培养小鼠巨噬细胞RAW264.7,施加机械力刺激,或用辛伐他汀预处理细胞60 min后再施加此刺激,用荧光探针H2DCFDA检测巨噬细胞ROS的表达水平,以细胞免疫荧光定量阳性率和SPSS统计软件对其表达水平进行分析。Western blot检测NADPH氧化酶1(NOX1)的表达。结果机械牵张力刺激介导的巨噬细胞ROS呈时间依赖性增多,以60 min最显著(P<0.05);辛伐他汀可抑制此刺激介导的巨噬细胞ROS表达增加,且抑制作用呈浓度依赖增强,以0.3μmol/L辛伐他汀的抑制作用最显著(P<0.05)。辛伐他汀可使机械牵张力介导的巨噬细胞NOX1表达显著减少。结论辛伐他汀可通过抑制NOX1的表达从而抑制由机械牵张力介导的小鼠巨噬细胞ROS的表达。