朊蛋白体外扩增技术对不同种属朊病毒检测敏感性分析

朊蛋白体外扩增技术包括实时震动诱导蛋白扩增(Real-time quaking-induced conversion,RT-QuIC)技术及蛋白错误折叠循环扩增(Protein misfolding cyclic amplification,PMCA)技术。为了分析朊蛋白体外扩增技术与传统的蛋白免疫印迹技术对于朊病毒毒株检测敏感性的差异,应用此三种方法对朊病毒小鼠适应株139A、ME7和S15以及仓鼠适应株263K毒株进行了检测及对比分析。结果显示,应用RT-QuIC方法以及三轮PMCA扩增方法,均可检测到10-9稀释度139A小鼠脑匀浆中的朊病毒,比Western blot方法敏感度提高了106倍;应用RT-QuIC方法以及三轮PMCA扩增方法,分别可检测到10-7稀释度及10-8稀释度ME7小鼠脑匀浆中的朊病毒,分别比Western blot方法敏感度提高了104倍及105倍;应用RT-QuIC方法以及三轮PMCA扩增方法,分别可检测到10-8稀释度及10-9稀释度S15小鼠脑匀浆中的朊病毒,分别比Western blot方法敏感度提高了105倍及106倍;应用RT-QuIC方法可检测到10-9稀释度263K仓鼠脑匀浆中的朊病毒,比Western Blot方法敏感度提高了106倍,但三轮PMCA扩增方法可检测到10-3稀释度的263K小鼠脑匀浆中的朊病毒,与Western Blot方法比较敏感度没有明显提高。本实验为优化朊蛋白体外扩增技术的检测条件、检测敏感性及该技术的临床应用提供了实验数据参考。

大黄素通过抑制半乳糖凝集素-3诱导甲状腺癌细胞内质网应激

目的观察大黄素抑制半乳糖凝集素-3(Gal-3)影响甲状腺癌细胞增殖及内质网应激(ERS)相关蛋白的变化。方法应用免疫组织化学与免疫印迹检测乳头状甲状腺癌(PTC)及其癌旁组织中Gal-3、增殖细胞核抗原(PCNA)表达量的差异;应用小干扰核糖核酸(siRNA)Gal-3干扰乳头状甲状腺癌细胞系(TPC-1)24 h后,观察细胞增殖能力及Gal-3、PCNA、ERS相关蛋白的变化;同时应用低(20μmol/L)、中(40μmol/L)、高(60μmol/L)浓度大黄素处理TPC-1细胞24 h后检测细胞增殖能力及Gal-3、PCNA、ERS相关蛋白的变化。组间比较采用t检验。结果PTC组织中的Gal-3、PCNA高于癌旁组织[Gal-3:(0.728±0.288)U/L比(0.197±0.158)U/L,t=2.805,P<0.05;PCNA:(0.854±0.127)U/L比(0.235±0.147)U/L,t=5.532,P<0.01];应用Gal-3 siRNA干扰TPC-1细胞24 h后,干扰组中的Gal-3及PCNA表达水平均低于非特异性对照组[Gal-3:(0.265±0.229)U/L比(1.315±0.268)U/L,t=5.153,P<0.01;PCNA:(0.318±0.095)U/L比(1.069±0.357)U/L,t=3.519,P<0.05],同时诱导ERS相关的葡萄糖调节蛋白78(Grp-78)、蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)和CCAAT/增强子结合蛋白(CHOP)增加[Grp-78:(1.210±0.110)U/L比(0.857±0.081)U/L,t=4.464,P<0.05;PERK:(0.957±0.114)U/L比(0.634±0.083)U/L,t=3.964,P<0.05;CHOP:(1.151±0.088)U/L比(0.431±0.057)U/L,t=11.958,P<0.01];在应用不同浓度的大黄素作用TPC-1细胞后出现与Gal-3 siRNA干扰后相似的结果,中、高剂量组中的Gal-3、PCNA蛋白表达水平均低于对照组[Gal-3:(1.061±0.087)U/L比(0.545±0.770)U/L比(0.433±0.836)U/L,t=7.686、9.001,P<0.01;PCNA:(0.879±0.052)U/L比(0.561±0.036)U/L比(0.567±0.043)U/L,t=8.703、7.962,P<0.01],ERS相关的Grp-78、PERK、CHOP蛋白表达均高于对照组[Grp-78:(0.597±0.035)U/L比(0.958±0.019)U/L比(1.002±0.020)U/L,t=15.970、17.654,P<0.01;PERK:(0.162±0.024)U/L比(0.990±0.036)U/L比(0.888±0.116)U/L,t=32.948、10.614,P<0.01;CHOP:(0.165±0.038)U/L比(0.954±0.065)U/L比(0.874±0.110)U/L,t=18.290、10.521,P<0.01]。结论大黄素可以通过抑制Gal-3蛋白表达减弱TPC-1细胞的增殖能力,诱导细胞的内质网应激。

朊病毒感染对细胞中三羧酸循环关键催化酶的影响研究

为了研究朊病毒感染对细胞氧化供能的主要途径—三羧酸循环关键催化酶的影响。使用ATP检测试剂盒检测朊病毒感染后细胞的ATP表达情况,采用蛋白免疫印迹方法检测朊病毒感染细胞中三羧酸循环关键催化酶的表达情况;使用细胞免疫荧光对催化酶进行细胞定位;应用线粒体分离试剂盒分离线粒体,检测线粒体中催化酶的表达情况。结果显示朊病毒感染后的细胞ATP表达水平明显降低,进一步检测三羧酸循环过程中三个主要的催化酶,发现这三个催化酶在朊病毒感染的细胞中表达量明显降低,免疫荧光实验显示催化酶与线粒体标志蛋白具有空间共定位现象,并发现在朊病毒感染细胞的线粒体中这三个催化酶的表达也显著降低。本研究发现朊病毒感染细胞中三羧酸循环催化酶的表达量明显降低,导致ATP产能下降,影响细胞代谢水平。