西方蜜蜂AmAGO1蛋白的分子特性、时空表达谱及抗体制备

【目的】Argonaute(AGO)家族是一类在进化上高度保守的蛋白家族,其在真核生物中主要参与形成RNA诱导沉默复合体(RNA-induced silencing complex,RISC),进而通过沉默基因表达参与诸多生物学过程。蜜蜂AGO蛋白的相关研究迄今仍然缺失。本研究拟通过预测西方蜜蜂Apis mellifera的AGO1(AmAGO1)理化性质和分子特性,解析AmAGO1在西方蜜蜂中的时空表达谱,并制备AmAGO1的多克隆抗体,为深入开展AmAGO1的功能与机制研究提供参考和基础。【方法】PCR扩增西方蜜蜂AmAGO1的编码序列(coding sequence,CDS);通过生物信息学预测AmAGO1蛋白的理化性质和分子特性;利用RT-qPCR检测AmAGO1在西方蜜蜂工蜂卵、3日龄幼虫、7日龄预蛹、8日龄预蛹、12日龄蛹以及1,2,6,12,15和18日龄成虫以及工蜂成虫触角、咽下腺、脑、表皮、中肠、脂肪体和毒腺中的表达量;构建原核表达质粒后诱导表达AmAGO1融合蛋白,并鉴定其表达形式;制备AmAGO1多克隆抗体,利用ELISA,Western blot和免疫沉淀(immunoprecipitation,IP)分别检测抗体效价、灵敏度和特异性。【结果】成功克隆到西方蜜蜂AmAGO1的CDS;AmAGO1含928个氨基酸,分子式为C4624H7332N1316O1325S51,分子量约为104.2 kD,等电点为9.31,平均亲水系数为-0.2965,含86个磷酸化位点及典型的PAZ结构域和PIWI结构域,但不存在典型的信号肽;AGO1在智人Homo sapiens、斑马鱼Danio rerio、黑腹果蝇Drosophila melanogaster、家蚕Bombyx mori、西方蜜蜂、东方蜜蜂A.cerana和欧洲熊蜂Bombus terrestris中具有较高的氨基酸序列一致性;西方蜜蜂和东方蜜蜂的AGO1聚为一支,同源性最高。AmAGO1在西方蜜蜂工蜂卵、幼虫、预蛹、蛹和成虫中均有表达但表达量存在差异,3日龄幼虫和7日龄预蛹中AmAGO1的表达量显著低于卵中的表达量,而8日龄预蛹和12日龄蛹中AmAGO1的表达量显著高于卵中的表达量;AmAGO1在1,2,6,12,15和18日龄工蜂体内均有表达但表达量也存在差异,其中1日龄成虫体内AmAGO1的表达量显著高于其他日龄成虫体内的表达量;AmAGO1在工蜂成虫触角、毒腺、脑、中肠、咽下腺、脂肪体和表皮中均有表达但表达量存在差异,触角中AmAGO1的表达量与咽下腺中的相差无几,但二者均显著高于毒腺、脑、中肠、脂肪体和表皮中AmAGO1的表达量;AmAGO1融合蛋白的表达形式为包涵体;制备的AmAGO1多克隆抗体具有较高的效价、灵敏度和特异性。【结论】AmAGO1可能是亲水性胞内蛋白,含有典型的PAZ结构域和PIWI结构域;AmAGO1在西方蜜蜂工蜂不同组织和不同发育阶段发挥潜在的重要功能;成功制备出高效价、高灵敏度和强特异性的AGO1多克隆抗体。

西方蜜蜂m 6A甲基转移酶的基因克隆、多克隆抗体制备及表达模式

【目的】本研究旨在克隆西方蜜蜂Apis mellifera RNA m 6A甲基转移酶14(methyltransferase 14,METTL14)基因AmMETTL14,分析AmMETTL14的理化性质和分子特性以及AmMETTL14在工蜂不同发育阶段和不同组织中的表达模式,并制备AmMETTL14多克隆抗体,为持续深入开展AmMETTL14的功能研究提供参考和基础。【方法】通过PCR扩增西方蜜蜂AmMETTL14的CDS并进行Sanger测序验证。使用相关生物信息学软件对AmMETTL14进行生物信息学分析,并构建系统进化树。通过原核表达系统诱导表达AmMETTL14融合蛋白,免疫新西兰白兔以制备多克隆抗体,利用ELISA和Western blot分别检测抗体的效价及特异性。采用RT-qPCR检测AmMETTL14在卵、幼虫、预蛹、蛹及工蜂成虫中以及刚出房工蜂成虫的触角、毒腺、脑、中肠、咽下腺、脂肪体和表皮7种组织中的相对表达量。【结果】成功克隆到西方蜜蜂AmMETTL14的CDS;AmMETTL14的分子式为C 1957 H 3113 N 567 O 589 S 15,分子量约为44.49 kD,脂溶系数为79.97,理论等电点为8.58,平均亲水系数为-0.59,不含典型的跨膜结构域和信号肽,可同时定位于细胞核、线粒体和细胞质;西方蜜蜂、中华蜜蜂A.cerana cerana、黑大蜜蜂A.laboriosa、东方蜜蜂A.cerana、大蜜蜂A.dorsata、小蜜蜂A.florea、欧洲熊蜂Bombus terrestris、金环胡蜂Vespa mandarinia、美洲东部熊蜂B.impatiens和黑腹果蝇Drosophila melanogaster的METTL14均含有MT-A70结构域和3个相同的保守基序;AmMETTL14与黑大蜜蜂的METTL14的氨基酸序列一致性最高(65.60%)且亲缘关系最近。制备的AmMETTL14多克隆抗体效价较高(大于512 K)且特异性较强。AmMETTL14在7和8日龄预蛹与卵中的表达量相近且均显著高于在3日龄幼虫中的表达量,在12日龄蛹中的表达量显著高于卵、幼虫和预蛹中的表达量,在6,12和15日龄工蜂成虫体内的表达量显著高于1日龄工蜂成虫体内的表达量;AmMETTL14在刚出房工蜂成虫脑和咽下腺中的表达量与触角中的表达量相近且均显著高于在毒腺、中肠、脂肪体和表皮中的表达量。【结论】研究结果表明,AmMETTL14可能为亲水性、非跨膜和胞内蛋白,AmMETTL14在幼虫生长发育中发挥潜在的调控作用,制备得到的AmMETTL14的多克隆抗体效价高、灵敏度高和特异性强,为进一步探究AmMETTL14的功能及其参与的表观调控机制打下了基础。

意大利蜜蜂Hippo信号通路相关基因及其全长转录本的鉴定与分析

采用Blast工具将已鉴定到的意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica,简称意蜂)全长转录本比对Nr数据库,共鉴定到意蜂Hippo信号通路中相关的49个基因及其550条全长转录本。运用Gffcompare软件将鉴定到的Hippo信号通路相关全长转录本与西方蜜蜂参考基因组(Amel_HAv3.1)上注释的转录本进行比较,分别延长西方蜜蜂参考基因组注释到Hippo信号通路的9个基因的5'UTR和7个基因的3'UTR。通过Astalavista软件鉴定到Hippo信号通路相关的4个基因的7次可变剪切(AS)事件,包括2次外显子跳跃、2次内含子保留和3次可变5'端剪接。通过PCR验证了1个基因的AS事件真实性。利用TAPIS pipeline鉴定到意蜂Hippo信号通路相关的24个基因含有1个及以上可变多聚腺苷酸化(APA)位点,其中含有1个APA位点的基因数量最多。通过TBtool软件鉴定APA位点上游motif的一致性序列HVNCCNBNDYVDVVHVNDBVDYCNBBDNNNHNNVNNVMNN。

东方蜜蜂微孢子虫DNA拓扑异构酶Ⅲ的分子特性与系统进化分析

利用相关生物信息学软件对东方蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)的DNA拓扑异构酶3(DTⅢ)进行了理化性质、分子特性、保守基序、结构域和系统进化的分析。结果表明:DTⅢ包含805个氨基酸,分子式为C4267 H6719 N1117 O1240 S34,分子质量约为94.60 ku,脂溶系数为81.84,等电点为9.08,平均亲水系数为-0.595,亲水氨基酸多于疏水氨基酸,不含典型信号肽;含有41个丝氨酸磷酸化位点,23个酪氨酸磷酸化位点及14个苏氨酸磷酸化位点;包含310个α⁃螺旋,117个β⁃折叠,37个β⁃转角及341个无规则卷曲;可同时定位于细胞核、细胞质和线粒体;东方蜜蜂微孢子虫与其他10种微孢子虫的DTⅢ均含有5个相同的保守基序(Motif 1、Motif 2、Motif 3、Motif 4和Motif 5)和2个相同的结构域(Toprim和Topoisom_bac);通过Mega 11.0软件构建东方蜜蜂微孢子虫和其他物种的DTⅢ的系统进化树,结果显示东方蜜蜂微孢子虫与绒鳌蟹肝孢虫(Hepato⁃spora eriocheir)的DTⅢ聚为一支,进化距离最近。研究结果明确了东方蜜蜂微孢子虫DTⅢ的理化性质和分子特性,并揭示东方蜜蜂微孢子虫与绒鳌蟹肠孢虫的DTⅢ亲缘关系最近,DTⅢ在东方蜜蜂微孢子虫和其他微孢子虫中具有较高的保守性。

意大利蜜蜂AmMETTL3基因的分子克隆与表达模式

为克隆意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica)的AmMETTL3基因,解析AmMETTL3蛋白的分子特性,并测定AmMETTL3在工蜂不同组织及发育时期的表达谱。通过PCR扩增AmMETTL3的CDS并进行Sanger测序验证;使用相关生物信息学软件预测AmMETTL3的理化性质和分子特性,鉴定METTL3的结构域和保守基序,并构建系统进化树;采用RT-qPCR检测AmMETTL3在工蜂7个组织及5个不同发育时期的相对表达量。结果表明:成功克隆到AmMETTL3的CDS并发现AmMETTL3不含典型的跨膜结构域和信号肽;METTL3在各种昆虫中高度保守且含1个MT-A70结构域和3个相同的保守基序;AmMETTL3与东方蜜蜂METTL3的亲缘关系最近;相较于触角中的表达量,AmMETTL3的表达量在咽下腺中极显著上调(P<0.01),在中肠中极显著下调(P<0.01);AmMETTL3在3日龄幼虫中的表达量极显著(P<0.01)低于卵中的表达量,在12日龄蛹中的表达量极显著(P<0.01)高于卵中的表达量,在2、6、12、15和18日龄工蜂体内的表达量极显著(P<0.01)低于1日龄工蜂体内的表达量。研究结果为深入探究AmMETTL3的功能及其参与的表观调控机制提供了参考和依据。