重组鸡α-干扰素的表达及其生物活性的初步研究

为获得重组鸡α-干扰素并对其进行生物活性研究,本试验对重组大肠杆菌进行诱导表达,收集重组鸡α-干扰素包涵体后进行复性纯化及免疫印迹试验,并通过测定病毒EID50,在接种H9亚型禽流感病毒、新城疫病毒和传染性支气管炎病毒的鸡胚中进行干扰素抗病毒活性试验,运用微变量细胞病变抑制法进行重组鸡α-干扰素抗病毒效价的测定。结果显示复性后重组鸡α-干扰素的免疫印迹试验成功获得了预期条带,在鸡胚中重组鸡α-干扰素具有显著的抗H9亚型禽流感病毒、新城疫病毒和传染性支气管炎病毒等活性作用。在CEF/VSV细胞系上测定重组鸡α-干扰素的抗病毒效价为1.5×210 U/mg左右,高浓度重组鸡α-干扰素具有一定的细胞毒性。结果表明重组鸡α-干扰素蛋白具有免疫原性和抗原性,在鸡胚内具有较好的抑制或杀灭H9亚型禽流感病毒、新城疫病毒和传染性支气管炎病毒的效果,呈广谱性,抗病毒效价较高,为下一步抗病毒制品的创制奠定基础。

猪繁殖与呼吸综合征病毒重组N蛋白间接ELISA检测方法的建立及应用

为建立一种敏感、特异、快速的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗体检测方法,本研究利用原核表达技术表达了PRRSV N蛋白,亲和层析纯化后作为包被抗原,通过对各反应条件优化选择,建立了PRRSV血清抗体的间接ELISA检测方法,并进行了交叉反应和重复性试验,以及同类成品试剂盒间的应用效果对比试验。最终确定了抗原包被最佳浓度为2μg/mL,血清最佳稀释度为1∶100,血清及酶标二抗孵育时间均为30min,显色时间为10min,检测猪瘟病毒、猪圆环病毒、猪伪狂犬病病毒等5种常见猪病病原的阳性血清均为阴性;该ELISA检测方法批内和批间重复性的变异系数均小于10%;与商品化ELISA试剂盒效果比较显示符合率为94.7%。本研究建立的间接ELISA方法将为猪群感染野毒PRRSV后的快速诊断及流行病学调查提供一种简便易行、快速高效的血清学抗体检测方法。

猪源植物乳杆菌的诱变选育及其对小鼠免疫性能的影响

为了获得1株具有较好耐酸耐胆盐、体外黏附率较高的植物乳杆菌,研究其对小鼠免疫性能的影响,试验将植物乳杆菌进行紫外诱变,对其耐酸和耐胆盐性能进行选育,将植物乳杆菌选育株BL-15冻干后,定量溶解,分3次口服(灌胃)BALB/c小鼠,采集血液、脾脏、粪便,处理后测定小鼠免疫性能指标的变化情况。结果表明,经过诱变后,从17株诱变株中成功筛选获得了1株耐酸耐胆盐较好、体外黏附率较高的植物乳杆菌BL-15,经小鼠口服后,提高了小鼠生长初期的脾脏指数及细胞因子IL-2的含量,加强免疫后肠内容物中SIgA含量与对照组相比,均差异显著(P<0.05)。说明该菌株可以诱导小鼠产生良好的黏膜免疫应答,提高小鼠的免疫性能。

鸡α干扰素基因的原核和真核表达载体的构建及鉴定

目的:为了构建鸡α干扰素基因真核和原核表达载体。方法:参照Genebank中发表的鸡源α干扰素基因进行密码子优化后,人工合成α干扰素基因片段489 bp,成功构建了干扰素基因克隆载体p MD18-T-IFN-α,经双酶切后,回收获得干扰素基因,分别与原核表达载体p ET-28a和真核表达载体p GAPZαA连接,转化到大肠杆菌Ressota和毕赤酵母中,分别进行PCR、酶切和测序鉴定。结果:成功构建了原核表达载体p ET-28a-IFN-α和真核表达载体p GAPZαA-IFN-α。结论:成功构建了鸡IFN-α基因的真核和原核表达载体,为鸡IFN-α干扰素的抗病毒活性研究提供了基础。

猪产毒素大肠杆菌K88黏附素FaeG基因重组乳酸菌对小鼠免疫性能的影响

目的为获得临床对猪大肠杆菌病较好的预防方法,研究猪产毒素大肠杆菌K88黏附素FaeG基因的重组乳酸菌对小鼠免疫性能的影响。方法将重组乳酸菌经口服(灌胃)免疫BALB/C小鼠,加强免疫后7 d处理小鼠,采集血液、脾脏、粪便,处理后采用试剂盒及间接ELISA方法,检查小鼠免疫性能变化情况。结果重组乳酸菌经口服免疫小鼠后,提高了小鼠生长初期的脾脏指数及细胞因子(IL-2)的含量,加强免疫后粪便中的sIgA与对照组相比,差异极显著(P<0.01),血清中猪ETEC(K88)的特异性抗体水平高于对照组,差异性达到了统计学上的显著水平(P<0.05)。结论含有猪ETEC K88黏附素FaeG基因的重组乳酸菌,可以诱导小鼠产生良好的针对猪产毒素大肠杆菌的全身体液和黏膜免疫应答。

鸡α干扰素基因的人工合成、表达及抗病毒活性研究

为了获得具有抗禽源病毒活性的鸡α干扰素,对Genebank中发表的鸡源α干扰素基因进行密码子优化后,人工合成α干扰素基因片段489 bp,构建了表达载体PET-28a-IFN-α,连接转化到大肠杆菌菌株中,经PCR、酶切和测序鉴定后,诱导产生干扰素包涵体蛋白,破碎、纯化、透析复性、冻干浓缩后测定蛋白浓度,按禽流感H9EID50的浓度分别与不同剂量干扰素等量混合,接种鸡胚0.2μL,收集病毒,测定血凝价。结果显示:成功构建了原核表达载体pET-IFN-α,复性后蛋白浓度为472μg/mL,试验组(47.2μg和23.6μg)的血凝价与生理盐水对照组比较,差异极显著(P<0.01)。表明重组干扰素蛋白在鸡胚内具有较好的抑制或杀灭H9禽流感病毒的效果,为下一步抗病毒制品的研发奠定了基础。

猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白的克隆表达及其生物学特性的初步研究

为了研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)N蛋白的生物学特性,根据Gen Bank上登录的PRRSV的基因序列设计引物,以生物研究院保存的PRRSV病料的总RNA为模板进行RT-PCR,获得N基因的完整开放阅读框为372bp,构建原核表达载体p ET-28a-N并转化到大肠杆菌BL21中,IPTG诱导表达得到重组蛋白包涵体,经破碎、纯化、透析复性后通过SDS-PAGE电泳检测和Western blot分析表达产物的特性。结果显示,获得的重组蛋白大小约为21KD,能与抗PRRSV N蛋白的多抗发生特异性反应,说明该蛋白具有良好的免疫原性。BCA法测定蛋白浓度为540μg/m L,说明蛋白表达量较高。因此,试验重组蛋白表达量较高,且具有良好的免疫原性。

猪产肠毒素大肠杆菌多重PCR快速检测试剂盒的研制及应用

为建立一种简单、快速、灵敏、准确的产肠毒素大肠杆菌检测方法,根据产肠毒素大肠杆菌LT、ST1、ST2保守基因序列分别设计合成了1对引物,建立了快速检测产肠毒素大肠杆菌的多重PCR方法,并对反应条件进行优化,组装成快速检测试剂盒。特异性检验表明参考菌株均可扩增出LT(282 bp)或ST1(183 bp)或ST2(360bp)的特异性条带,而非大肠杆菌均未扩增出任何条带。检测灵敏度达66 CFU,而且稳定性良好,保质期可达12个月以上。通过对临床样品的检测,证实该试剂盒具有操作简便、快速、灵敏度高、特异性强、重复性好、稳定性高等优点。