PhiC31整合酶电穿孔鸡成纤维细胞诱发位点特异性基因盒交换

旨在验证直接电穿孔重组蛋白PhiC31能否在鸡DF-1细胞中诱导PhiC31介导的基因盒交换。本研究通过原核表达和经亲和层析纯化获得SUMO-His-PhiC31融合蛋白,利用SUMO酶切除SUMO-His标签,获得天然的PhiC31蛋白。这两种蛋白先与pBCPB+质粒在试管内共孵育进行分子重组反应。之后,先将带有attP TT-DsRed2-attP CT片段的“着陆点”(landing pad,LP)质粒通过电穿孔导入DF-1细胞,然后进行第二次电穿孔,将带有attB TT-EGFP-HiBiT-attB CT的donor质粒连同PhiC31蛋白导入上述DF-1细胞,验证DsRed2-EGFP基因盒交换事件发生。结果显示,成功构建了原核表达载体pET-28a-SUMO-PhiC31,经IPTG诱导,该重组质粒在大肠杆菌中以可溶性方式表达SUMO-His-PhiC31融合蛋白,经亲和层析纯化,SUMO-His-PhiC31蛋白的产量达12 mg·L-1;该融合蛋白和切除SUMO-His标签的天然PhiC31蛋白均成功触发了pBCPB+质粒attP和attB位点之间的重组反应,重组效率基本一致(50%vs.52%);以脂质体转染法将PhiC31真核表达质粒pCMVInt与LP质粒和donor质粒共转染DF-1细胞,荧光显微镜观察证实了DsRed2-EGFP置换现象;以电穿孔方式将LP质粒、donor质粒和PhiC31蛋白先后导入DF-1细胞,获得了相同结果,表明PhiC31蛋白引发了attP TT与attB TT、attP CT与attB CT之间的重组反应。通过原核表达获得的PhiC31蛋白具有生物活性,有望成为一种重要试剂而用于Easi-CRISPR-TARGATT介导的转基因鸡研究。

CRISPR/Cas9 knock-in介导的输卵管特异性表达转基因鸡研究进展

利用动物生物反应器生产重组蛋白是一种具有应用前景的生物技术。鸡输卵管生物反应器是理想的动物生物反应器之一,其优点在于表达的外源蛋白能够分泌到蛋清中,可避免蛋白提取过程中对鸡本身造成伤害,同时蛋清成分简单,便于后期的纯化。目前利用慢病毒结合原始生殖细胞(PGCs)制备转基因鸡被认为是最可行的方法,但因外源基因随机整合且生殖系传递效率较低,使转基因鸡研究受到技术上的限制。而2013年问世的CRISPR/Cas9基因敲入(CRISPR/Cas9 knock-in)技术能够使外源基因精准定向插入基因组特异性位点,这对生产输卵管特异性转基因鸡具有重大意义。文章综述了鸡输卵管反应器的研究进展、CRISPR/Cas9 knock-in技术在输卵管特异性表达转基因鸡研究和鸡育种领域的应用现状,并指出了目前存在的问题和相应的解决办法。

7例犬猫胃肠道异物的诊断与治疗

犬猫误吞骨块、鱼钩、缝针、硬币等非线性异物和丝袜、塑料袋、毛巾、线绳等线性异物,使其滞留在胃肠道造成胃排空困难和肠道部分或完全梗阻。本文报道了7例犬猫胃肠道异物的诊断和治疗过程。应用腹部X-线平片和钡餐造影诊断胃肠道异物,经腹中线切口实施剖腹探查术验证诊断结果。最后通过胃切开术或肠切开术,或尸体剖检确认胃肠道异物为线性异物,还是非线性异物。结果表明,2例狗胃肠道异物是线性异物,其中1个病例通过胃切开术和肠切开术得以确认,另1个病例通过尸体剖检得以确认;其余4例狗和1例猫胃肠道异物属于非线性异物,并通过肠切开术得到确认。及时诊断和尽早实施手术治疗,配合术后抗感染治疗,预后良好。

1例犬创伤性膈疝的诊断与治疗

犬膈疝是因交通工具撞击或高处坠落等创伤导致横膈膜破裂,腹腔脏器通过破例孔进入胸腔的一种疾病。进入胸腔的脏器压迫肺和心脏,患病动物出现呼吸困难、不耐受运动、心动过速、黏膜的发绀、甚至休克等症状。本文报道了1例犬创伤性膈疝伴发肋骨骨折的诊断和治疗过程。结果表明,X线检查和钡餐造影对膈疝诊断有重要作用;及早实施腹腔切开术和疝修补术,配合术后抗感染治疗,取得了良好疗效。

南宁地区犬细小病毒病流行病学调查

犬细小病毒（Canine parvovirus，CPV）病是由CPV引起的一种急性、热性、传染性疾病，临床上以出血性肠炎或非化脓性心肌炎为特征。其发病率和死亡率高，临床症状多样，容易继发其他细菌以及其它病毒的混合感染和二次感染，严重影响犬的健康和养犬业的发展。该病的传染性强，是犬科动物最常见的最主要的传染性病毒性疾病之一。

2例犬胸部食道梗阻的诊治

犬胸部食道梗阻大多因吞咽了边缘锐利的骨头、金属、玩具等异物而引起,以多涎、呕吐和频繁的吞咽动作,以及呼吸困难为特征。完全阻塞的病例,液体和固体食物吞咽后立即返流,不完全阻塞的病例,流质食物可通过梗塞部位。体积较大的异物压迫气管会造成呼吸困难。尖锐的异物可以造成食道穿孔,导致胸膜炎发生,患犬表现为厌食、发热和胸腔积液,甚至出现感染性休克。本文报道了2例犬胸部食道完全梗阻的诊断和治疗过程。结果表明,X线检查对识别异物和确定阻塞部位有特殊作用;对患病动物及早实施开胸术和食道切开术取出异物,配合术后抗感染治疗和静脉营养支持,预后良好。

转基因鸡制备技术研究进展

本文综述了转基因鸡的研究及应用,并介绍了3种常用的制备方法,包括外源基因受精卵注射、逆转录病毒介导转基因、利用慢病毒载体实现转基因的介入和导向,以期为转基因技术的应用提供参考。

犬瘟热核衣壳蛋白原核表达及蛋白纯化

犬瘟热病毒(CDV)是一种单链RNA病毒,作为转录因子合成蛋白,共编码六个结构蛋白,其中核衣壳蛋白N(CDV-N)是保守性较强的免疫原性蛋白,在病毒感染时能引起强烈的抗体反应,对于CDV的诊断具有非常重要的价值。本研究的目的是构建CDV-N蛋白原核表达载体,利用原核表达技术纯化CDV-N蛋白。利用DNAStar软件预测CDV-N蛋白抗原表位,选择588bp截短体用于原核表达。设计引物,以本实验室保存的pMD18-T-CDV质粒为模板,PCR扩增CDV-N588片段,并将其TA克隆至pMD18-T载体。通过酶切鉴定和DNA测序,从pMD18-T-CDV-N588质粒上切取CDV-N588片段,再将其亚克隆至pET30a原核表达载体,构建重组质粒pET30a-CDV-N588。该重组质粒转化大肠杆菌BL21,ITPG在37℃诱导表达His-CDV-N588融合蛋白,并用SDS-PAGE和Western Blotting加以验证。相同条件下大量增菌诱导,Ni-NTA琼脂糖珠在变性条件下分离纯化His-CDV-N588融合蛋白,再次用SDS-PAGE和Western Blotting进行验证。结果表明:pET30a-CDV-N在大肠杆菌BL21中得到高效表达;SDS-PAGE和Western Blotting检测证实,我们成功纯化了His-CDV-N588融合蛋白。本研究为制备CDV-N588蛋白单克隆抗体和研制胶体金诊断试纸条奠定了基础。

浅谈肉鹅屠宰检疫要点与监督管理

我镇是乌鬃鹅养殖大镇,存栏量约285万只,每年屠宰量约为110万只,肉鹅产品是供往珠三角市场及全国各地的重要来源。在养鹅业中,肉鹅的屠宰和检疫是保证肉鹅产品质量的关键环节。只有搞好肉鹅屠宰检疫工作,才能保证肉鹅产品的安全,为人们提供高质量的肉鹅产品。本文浅析了肉鹅屠宰检疫的要点,探讨了如何监督和管理肉鹅的屠宰检疫工作,提高肉鹅屠宰检疫的质量和保证肉鹅产品的安全。

动物组织冷冻切片法的改良及应用

冷冻切片的优点是能完好保存有机溶剂及热敏感抗原,其缺点是制片过程中形成冰晶影响免疫组织化学检测结果。为了解决这一难题,我们对现有的冷冻切片法进行了改良。多聚甲醛固定和蔗糖脱水后的脑、肺和睾丸组织,在包埋和切片之前,利用OCT包埋剂(聚乙二醇和聚乙烯醇水溶性混合物)进行预包埋,切片后进行苏木精伊红染色(hematoxylin eosin staining,HE染色)和免疫组织化学染色(Immunohistochemical staining,IHC染色),并比较了改良冷冻切片法、常规冷冻切片法和石蜡切片法制作的切片HE和IHC染色效果。结果显示,切片前使用OCT包埋剂充分浸润组织6~48 h,可显著地提高冷冻切片质量;与常规冷冻切片法相比,用改良法制作的睾丸和脑组织冷冻切片结构更加清晰,因冰晶形成的空洞较少,总体质量均得到极大提高;与传统石蜡切片相比,改良法制作的肺组织冷冻切片质量尤佳。本研究建立了一种适用于免疫组织化学研究的冷冻切片新方法,无需使用液氮骤冷,大幅降低了多组织样品制片的难度,并且获得了正确的IHC染色结果,从而简化了实验流程,为组织形态学研究和抗原检测提供了可靠手段。

人γ干扰素转座子质粒构建及其在HEK293T细胞中的表达

[目的]克隆人γ干扰素(hIFNγ)基因,借助自剪切肽P2A,构建hIFNγ-P2A-RFP(红色荧光蛋白)融合基因转座子表达载体,并在HEK293T细胞中检测其表达水平。[方法]首先,以脂多糖(LPS)激活人外周血淋巴细胞,提取总RNA,经RT-PCR扩增hIFNγ基因;再通过重叠延伸PCR,获得hIFNγ-P2A-RFP融合基因,并将其插入PB002G转座子载体。经双酶切和DNA测序鉴定,将重组质粒转染HEK 293T细胞,荧光显微镜观察RFP表达,Western Blotting检测hIFNγ蛋白表达。[结果]克隆了hIFNγ基因,成功构建了PB-hIFNγ-P2A-RFP重组质粒;荧光显微镜观察发现RFP在HEK 293T细胞表达,转染效率达39.3%;Western Blotting检测显示,特异性蛋白条带约为21 kDa,与预期的hIFNγ蛋白大小一致。[结论]成功构建了人γ干扰素PB转座子真核表达质粒,该质粒在HEK 293T细胞中高效表达。