佐剂对两种旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂免疫影响的研究

在寄生虫感染过程中,丝氨酸蛋白酶抑制剂在虫体与宿主相互作用间发挥着重要作用。在免疫过程中,不同佐剂的促免疫应答能力和提高免疫保护能力均不同。为了比较不同佐剂对两种丝氨酸蛋白酶抑制剂(TsAdSPI和TsKaSPI)免疫保护性的影响,通过对免疫剂量进行优化,应用间接ELISA的方法分析两种SPIs抗体应答,分别在肌肉虫攻击感染后第1天、第3天、第7天、第10天剖杀小鼠取成虫并计数,计算成虫减虫率。结果显示,用3种不同剂量(20、50μg和100μg)的重组蛋白免疫小鼠,50μg与100μg蛋白剂量免疫组诱导产生类似的抗体水平,且均高于20μg组;免疫组弗氏佐剂、ISA 206佐剂和铝佐剂分别与重组蛋白乳化后免疫,可诱导相似的免疫应答及成虫减虫率,其中佐剂ISA 206和氢氧化铝的保护效果更好。

旋毛虫Serpin基因在不同发育时期的mRNA表达水平变化及虫体表达特性

为研究旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂(Serpin),基因在不同发育时期的mRNA表达水平变化,本研究应用实时荧光定量PCR技术对不同发育时期的虫体的Serpin在mRNA表达水平进行检测。同时利用鼠抗重组蛋白血清对Serpin在旋毛虫成虫、新生幼虫、成囊前期幼虫及肌幼虫中进行定位,以鉴定该Serpin基因的表达特性。研究结果显示,在成虫时期,3 d时表达量明显高于6 h和5 d的表达量(P﹤0.05);成囊前期表达量很低,其中18 d时表达量最低(P﹤0.05);肌幼虫时期在26 d、38 d和48 d均有大量表达(P﹤0.05)。免疫荧光染色结果表明,Ts Serpin蛋白在5 d成虫期的体表表达;在新生幼虫和14 d成囊前期幼虫的体内体表均有表达;38 d肌幼虫时期明显可见表皮及体内均有表达。本实验为探究旋毛虫在宿主体内免疫逃避机制奠定基础。

两种旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂对巨噬细胞炎性细胞因子mRNA表达的影响

丝氨酸蛋白酶抑制剂在寄生虫入侵宿主的过程中发挥着关键作用,能够参与到入侵宿主、免疫逃避、炎症反应、凝血系统和细胞迁徙等过程。为了探讨两种丝氨酸蛋白酶抑制剂(Ts Ad SPI和Ts Ka SPI)对巨噬细胞所分泌炎性细胞因子的调节作用,应用实时荧光定量PCR技术对两种SPIs分别处理的小鼠巨噬细胞进行TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-10、TGF-βmRNA表达水平的检测。结果显示,Ts Ad SPI和Ts Ka SPI均可不同程度的抑制LPS活化的小鼠巨噬细胞促炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-12 mRNA的表达水平。并且两种SPI均可不同程度的促进巨噬细胞抗炎性细胞因子IL-10和TGF-β的表达。表明这两种旋毛虫SPI可通过调节宿主巨噬细胞影响入侵时宿主的免疫应答。

两种旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂对小鼠免疫保护效果的评估

为评估旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂对BALB/c小鼠的免疫保护作用,选用2种重组表达的Serpin型和Kazal型旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂(TsAdSPI和TsKaSPI),联合弗氏佐剂通过腹腔注射的方式单独免疫小鼠,用间接ELISA法检测免疫后小鼠特异性血清抗体IgG以及IgG亚型(IgG1和IgG2a)的水平,用CCK-8法测定重组蛋白刺激后脾淋巴细胞的增殖情况,用ELISA法检测脾淋巴细胞培养液上清中细胞因子IFN-γ、IL-10、IL-12和IL-4的水平;使用旋毛虫肌幼虫攻击感染免疫后的小鼠,计算并分析小鼠肠道成虫减虫率及肠道病理变化,并评估TsAdSPI和TsKaSPI与ISA206佐剂联合免疫小鼠后对小鼠肠道成虫减虫率的影响。结果表明,与PBS组相比,2种重组蛋白所诱导的IgG和IgG亚型抗体水平均明显升高,IL-12、IFN-γ、IL-4和IL-10表达水平也均显著升高,且重组蛋白可诱导免疫小鼠脾淋巴细胞的体外增殖;攻虫结果表明,2种重组蛋白免疫后小鼠肠道旋毛虫成虫数量较PBS组显著减少且肠道病理变化减轻;2种重组蛋白联合免疫组的成虫减虫率高于单独免疫组。上述结果表明,重组蛋白TsAdSPI和TsKaSPI均可诱导小鼠产生较强的体液免疫和细胞免疫应答,并且能够在一定程度上阻止旋毛虫肌幼虫对小鼠肠道的入侵,减轻旋毛虫对小鼠肠道的病理损伤,且TsAdSPI和TsKaSPI联合免疫降低旋毛虫入侵的效果更显著。

旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂对旋毛虫体外入侵肠上皮细胞的影响

为探究2种旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂Ts Ad SPI和Ts Ka SPI对旋毛虫体外入侵肠上皮细胞的影响,建立了旋毛虫-Caco-2体外侵染模型,采用IPTG诱导大肠杆菌表达这2种旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白并大量纯化,探究不同剂量、不同作用时间Ts Ad SPI和Ts Ka SPI单独及共同作用于侵染模型对旋毛虫体外入侵肠上皮细胞的影响。结果表明：Ts Ad SPI和Ts Ka SPI对旋毛虫入侵肠上皮细胞均有促进作用：2种蛋白单独作用时,剂量为100 g且作用时间为5 h时,入侵率最高;2种蛋白共同作用时,剂量为100 g且作用时间为3 h时,入侵率最高;并且这2种蛋白的单独作用效果优于共同作用效果,这2种蛋白共同作用产生拮抗效果。为进一步研究旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂对旋毛虫入侵宿主的影响奠定了基础。