丹参SmRopGEF1基因的克隆、亚细胞定位与表达分析

目的:克隆丹参SmRopGEF1基因,研究其编码蛋白的亚细胞定位及其对逆境胁迫的应激反应和激素诱导下的表达水平。方法:根据前期丹参转录组测序结果设计SmRopGEF1基因特异引物,利用聚合酶链式反应(PCR)扩增SmRopGEF1基因序列;使用生物信息学方法分析SmRopGEF1蛋白序列特征及进化关系;构建pET28a-SmRopGEF1原核表达载体并转化至大肠埃希氏菌中诱导表达,构建35S启动的SmRopGEF1的绿色荧光蛋白原生质体瞬时表达载体,利用激光共聚焦显微镜观察SmRopGEF1的亚细胞定位;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测逆境胁迫(低温、盐及干旱)和激素诱导(生长素、脱落酸、茉莉酸甲酯)下的基因表达量。结果:丹参SmRopGEF1基因开放阅读框(ORF)全长为1701 bp,编码566个氨基酸,蛋白相对分子质量是62362.99。生物信息学分析显示SmRopGEF1蛋白含有1个PRONE保守结构域,系统进化树分析表明SmRopGEF1蛋白与芡欧鼠尾草和一串红RopGEF1蛋白为高同源蛋白。成功构建pET28a-SmRopGEF1原核表达载体并在大肠埃希氏菌Rosetta(DE3)菌株中表达、纯化出SmRopGEF1重组蛋白。亚细胞定位的结果显示SmRopGEF1存在于植物细胞的细胞核中。qRT-PCR实验结果表明盐胁迫和冷胁迫能够显著提高SmRopGEF1的表达量;干旱胁迫后丹参愈伤中SmRopGEF1表达量下降。茉莉酸甲酯诱导后SmRopGEF1表达量升高。结论:克隆了丹参SmRopGEF1基因,其在抗逆胁迫中起到重要作用并且可能参与茉莉酸甲酯信号转导。研究结果丰富了丹参防御反应机制的研究,为选育丹参抗逆优良品种、提高丹参的产量与品质提供了参考。

基于DNA条形码及HPLC对市售刺五加的种质资源鉴定和质量评价

刺五加Acanthopanax senticosus(Rupr.et Maxim.)Harms是我国东北道地药材之一,本研究根据之前的叶绿体基因组测序结果,选取atpI和atpB_rbcL基因片段对市售刺五加样品进行种质资源鉴定,并利用HPLC对其紫丁香苷含量进行测定,以期确定市售刺五加的主流种质和质量。本研究从24省47市收集80份刺五加样品并提取DNA,通过PCR扩增atpI和atpB_rbcL基因片段,分析结果表明,2个基因片段联合分析形成7个单倍型(H2、H5、H8、H10、H12、H14、H23),其中来自黑龙江伊春、哈尔滨尚志、黑龙江绥化、辽宁抚顺、辽宁本溪、吉林长白和吉林靖宇的单倍型H2是主流单倍型,占总样本量的58.75%。H14和H23为产地独有单倍型,分别来自黑龙江省双鸭山市饶河县和黑龙江省绥化市明水县。通过HPLC检测市售刺五加样品中的紫丁香苷含量,结果表明73.96%样品紫丁香苷含量符合药典标准。样品间的紫丁香苷含量差异显著,在0.0037%~0.5245%之间,相差0.5208%,说明刺五加市场样品质量参差不齐,但是不同单倍型之间市售刺五加紫丁香苷含量没有显著性差异。市场样品中单倍型H23中的紫丁香苷含量比较高,因此可能是质量比较好的种质。本文对刺五加市场样品的种质资源和药材质量进行研究,有利于指导刺五加市场样品流通、临床合理用药和后续优良品种筛选。

断奶操作对母猪断奶后发情率的影响

为了找出最佳的母猪断奶操作方法,试验分别从母猪断奶的时间、断奶后合群以及车辆运输3个方面做了对比。结果表明:在下午17:00断奶比上午8:00断奶的发情率高出10.79个百分点(P<0.05),断奶后直接赶入定位栏比断奶后合群的发情率高出29.41个百分点(P<0.05),断奶后用车辆运输时时速控制在20 km/h比时速为40 km/h发情率高出25.49个百分点(P<0.05)。结论:母猪断奶已经是一个很大的应激过程,故断奶后不能再增加其他任何的应激方式,不然会降低母猪的断奶7 d内发情率,安静断奶才能保证最佳的母猪断奶后7 d内发情率。

知母特异性DNA条形码筛选、种质资源鉴定与遗传多样性分析

知母Anemarrhena asphodeloides是临床方剂和中成药中常用药材。该研究利用Illumina平台测序获得7份不同产地的知母叶绿体基因组序列,通过比较基因组学分析筛选特异性DNA条形码,并利用DNA条形码对全国不同产地知母样品进行种质资源鉴定与遗传多样性分析。7份知母叶绿体基因组均具有环状结构,全长为156801~156930 bp,均注释113个基因,其中蛋白编码基因79个、tRNA基因30个、rRNA基因4个;比较基因组学分析显示rps16、trnG-GCC、atpF、rpoB、ycf3、rpl16、ndhF、trnS-GCU_trnG-GCC、petN-psbM、ndhF-rpl32可作为潜在的知母特异性DNA条形码。该研究选取序列长度在700~800 bp,且易于扩增的ycf3(第2内含子区)和atpF(内含子区)序列对26个产地594份知母样品进行PCR扩增和测序,序列分析结果显示ycf3和atpF序列分别能鉴定6、8个单倍型,2个序列联合分析能鉴别17个单倍型,命名为Hap1~Hap17。26个知母居群单倍型多样性(Hd)为0.68;核苷酸多样性(Pi)为0.93×10^(-3);遗传距离为0~0.0031,表明知母种内遗传多样性较丰富。中介邻接网络分析显示Hap5为最古老单倍型,主要分布在河北保定易县、山西忻州河曲县和山西临汾襄汾县。该研究对知母品种的鉴定、种质资源保护和开发及产地鉴别具有重要指导意义,为进一步揭示知母的遗传进化规律提供了研究基础。

北柴胡特异DNA 条形码筛选及种质资源鉴定

目的基于北柴胡Bupleurum chinense叶绿体基因组筛选特异性DNA条形码,并利用特异DNA条形码鉴定不同产地北柴胡种质资源。方法利用Illumina HiSeq X Ten平台对北柴胡进行叶绿体基因组测序,利用mVISTA软件和核酸多样性分析筛选特异性片段,基于特异性片段进一步分析不同产区北柴胡样品单倍型。结果不同产地3份北柴胡叶绿体基因组全长为155557~155959 bp,均呈现典型的环状四分体结构,均编码131个基因。trnV-UAC、trnC-GCA_petN、petN_psbM、ndhF_rpl32可以作为潜在的北柴胡种质资源鉴定的特异性DNA条形码。基于扩增效率,选择petN_psbM和ndhF_rpl32对来自4省7个产地177份北柴胡样品进行序列分析,结果表明petN_psbM和ndhF_rpl32分别有91和78个变异位点,分别鉴定到28、29个单倍型;两段序列联合分析形成40个单倍型(Hap1~Hap40),各单倍型的遗传距离为0~0.022。6个产地拥有特有单倍型,可以将不同产地的北柴胡种质资源进行区分。结论利用比较叶绿体基因组学筛选的特异DNA条形码petN_psbM和ndhF_rpl32可以用于北柴胡种内种质资源鉴定,为后续鉴定北柴胡的产地来源、种质资源保护利用和育种等工作奠定基础。

北苍术特异性DNA条形码筛选、种质资源鉴定及遗传多样性分析

北苍术Atractylodes chinensis具有重要药用价值和经济价值。本研究利用Illumina平台测序获得4份不同产地的北苍术的叶绿体全基因组序列,筛选特异DNA条形码,并利用特异DNA条形码对不同产区北苍术样品种质资源鉴定及居群的遗传多样性分析。该4份北苍术叶绿体全基因组均为典型的环状四分体结构,均注释112个基因。比较基因组学研究结果表明ccsA和trnC-GCA_petN是潜在的北苍术种内鉴别的特异DNA条形码。选择ccsA和trnC-GCA_petN对来自9省14产区的256份样品进行PCR扩增,扩增效率为100%。序列分析结果表明ccsA和trnC-GCA_petN分别有11和22个变异位点,分别能鉴定16和22个单倍型,两段序列联合分析鉴定39个单倍型,命名为Hap1~Hap39,其中占比最多和分布最广的基因型为Hap9。单倍型多样性(Hd)=0.896,核苷酸多样性(Pi)=0.002 22,说明北苍术在物种水平上有较高的遗传多样性。各单倍型的遗传距离为0.000 00~0.004 88,说明各个单倍型之间有较小的遗传差异。系统进化树分析结果表明, 39个单倍型有很近的亲缘关系,并且与除白术外其余同属类群形成明显的两个分支。本研究为后续鉴定北苍术产地来源和后续种质资源保护和育种方面起到重要作用。

刺五加特异性DNA条形码筛选、种质资源鉴定及遗传多样性分析

刺五加Eleutherococcus senticosus是东北地区道地药材之一。该研究对来源于不同道地产区的3份刺五加的叶绿体基因组进行比较分析并筛选特异性DNA条形码,并基于筛选出的特异性DNA条形码对道地产区的刺五加进行种质资源鉴定和遗传多样性分析。3个不同道地产区的刺五加叶绿体基因组全长为156779~156781 bp,叶绿体基因组呈典型的四分体结构,含有的基因数量均为132个,其中蛋白质编码基因87个,tRNA 37个,rRNA 8个,其叶绿体基因组比较保守。叶绿体基因组序列分析结果表明atpI、ndhA、ycf1、atpB-rbcL、ndhF-rpl32、petA-psbJ、psbM-psbD、rps16-psbK可作为潜在的刺五加特异性DNA条形码。该研究选择序列长度为700~800 bp且易于扩增的atpI和atpB-rbcL片段对道地产区的13个产地184份刺五加样品进行扩增,序列分析结果表明atpI和atpB-rbcL分别能鉴定9、8个基因型,2段序列联合分析形成23个基因型,命名为H1~H23,分布最广和占比最多的单倍型为H10,H2次之;单倍型多样性和核苷酸多样性分别为0.94和1.82×10^(-3),遗传多样性较为丰富;中介邻接网络分析结果显示23种基因型可分为4类,其中,单倍型H2是最古老单倍型,并以H2为中心呈星状辐射,说明其在道地产区发生种群扩张。该研究可为刺五加道地药材遗传品质研究和刺五加的叶绿体基因工程研究奠定基础,进一步加深对刺五加居群的遗传机制研究,为刺五加遗传进化研究提供新思路。

基于DNA条形码及HPLC对市售黄芩的种质资源鉴定和质量评价

黄芩Scutellaria baicalensis是我国常用的大宗药材,该研究根据以前的叶绿体基因组测序结果,选取trnH-psbA、petA-psbJ、ycf4-cemA序列对市售黄芩样品进行种质资源鉴定,并通过HPLC测定市售样品的黄芩苷含量,以期确定检测黄芩市场样品的最佳DNA条形码,市场样品的种质资源和质量。该研究从我国24个省收集104份样品并提取DNA进行PCR扩增,trnH-psbA、petA-psbJ、ycf4-cemA 3段序列的扩增效率分别为100%、59.62%、25.96%;序列分析结果表明利用trnH-psbA、petA-psbJ、ycf4-cemA分别能够鉴定5、4、2个基因型,但是与野生型基因型序列不相同,3段序列联合分析仅形成6个基因型;系统进化树和遗传距离分析结果表明,trnH-psbA片段可用于鉴别黄芩真伪样品,因此trnH-psbA片段为鉴定市场样品种质资源最佳片段,对其所鉴定的市场样品基因型(THap1~THap5)进行分析,发现THap2为市场样品主要流通基因型,占总样品量的86.55%,说明市场黄芩样品种质资源比较少。HPLC检测市售黄芩样品中的黄芩苷含量结果表明,所有采集的市售黄芩样品黄芩苷含量均超过药典规定标准,样品之间黄芩苷含量差异显著,最大相差12.21%,说明市售黄芩样品质量参差不齐,而且不同采集省份和各个基因型之间的黄芩苷含量没有显著性差异。该研究为建立黄芩鉴定标准化体系提供依据,有利于指导黄芩市场样品的流通及临床科学合理用药。

丁香属植物的化学成分和药理活性研究进展

木犀科丁香属植物,自然分布于欧亚地区,在世界范围内约20余种,我国约有16种,特有种10种。丁香属植物大部分用作传统医药和园林观赏,如蒙古族药山沉香来源于羽叶丁香的根、茎及粗枝,常用来治疗胸闷气短、心肌缺血等心肺疾病。该文在2015年综述的基础上对近五年丁香属植物的化学成分与药理作用研究进展进行了系统的总结展望,为丁香属植物进一步开发研究和临床应用提供了参考。