适合人肌母细胞的无血清培养基

背景:肌母细胞体外培养大多使用添加胎牛血清培养基,存在很多不足,开发无血清培养基,更加稳定、安全、经济,有广泛的应用前景。目的:初步探索适合人肌母细胞培养的无血清培养基。方法:配制含胎牛血清培养基(DMEM/F12 1∶1添加胰岛素样生长因子1、碱性成纤维细胞生长因子和体积分数20%胎牛血清),间充质干细胞无血清培养基组(无血清培养基、2%血清替代物、2 mmol/L L-谷氨酰胺,人脐带间充质干细胞,细胞纯度大于99%,UltraC ULTURETM添加血清替代物,谷氨酰胺)。自制无血清培养基组(GibcoTM添加胰岛素样生长因子1,碱性成纤维细胞生长因子,谷氨酰胺)。3种培养基分别对人肌母细胞分别进行培养,观察肌母细胞的形态、免疫组织化学的鉴定,计算克隆的形成率,绘制细胞生长的曲线,MTT检测肌母细胞的活性,比较3种培养基培养肌母细胞增殖、分化的差异。结果与结论:各组细胞形态上无明显差异;各组免疫组织化学鉴定肌母细胞纯度均达99%;含胎牛血清培养基组和自制无血清培养基组克隆形成率显著高于间充质干细胞无血清培养基组(P<0.01),含胎牛血清培养基组克隆形成率显著高于自制无血清培养基组(P<0.01);含胎牛血清培养基组与自制无血清培养基组细胞数远高于间充质干细胞无血清培养基组;自制无血清培养基组细胞活性显著高于含胎牛血清培养基组和间充质干细胞无血清培养基组(P<0.01)。自制无血清培养基组可有效用于肌母细胞的培养,在促进肌母细胞早期贴壁、增殖上还需进一步优化。

内毒素血症的犬体温及相应细胞因子动态变化观察

目的观察注入内毒素后犬体温及血清中相应细胞因子水平动态变化。方法12只比格犬分为实验组（8只）和对照组（4只）。实验组静脉注射内毒素制造内毒素血症模型，对照组注射等量生理盐水，之后在相应的时间点测量肛温，并取血监测血清中内毒素及细胞因子的水平。结果实验组的内毒素水平在造模后24h达到峰值（306．56±10．57）EU／mL，随后下降，96h时内毒素为（3．11±1．41）EU／mL，与造模前（0．048±0．017）EU／mL相比差异有统计学意义（P〈0．05）。实验组体温上升并达峰值（40．2±0．26）℃，48h后又下降，对照组体温趋于平稳。实验组细胞因子TN-α、IL-1β、IL-6、IL-8水平在造模后开始上升，达峰值后下降。结论造模后体温和细胞因子随血液中内毒素水平的变化而变化。

吸入麻醉应用于犬实验的效果观察

目的探讨吸入麻醉应用于犬实验中的麻醉效果。方法将8只Beagle犬进行肌注诱导麻醉后，转入面罩式麻醉机维持麻醉。分别在麻醉前、麻醉后的10、20、60、120min观察犬的生物反射、镇静镇痛效果、肌肉松弛程度以及苏醒时间的情况，并在麻醉前、麻醉后30、60、90、120min抽取静脉血，测其电解质及葡萄糖的水平。结果有效性：犬无眼睑反射，无痛感，对声音刺激不敏感，牵拉四肢无阻力，有角膜、肛门反射；犬的平均苏醒时间为（8．63±1．41）min.安全性：与麻醉开始时相比，体温在麻醉20min开始下降[（38．08±0．25）℃比（37．50±0．12）℃，P〈0．05]，呼吸频率从麻醉10min开始下降[（23．25±3．69）次份比（20．00±0．93）次／分，P〈0．05]，血氧饱和度在麻醉10rain开始下降[（98．00±1．07）％比（95．50±1．25）％，P〈0．05]；呼吸频率与血氧进行pearsons相关分析具有正相关性（P〈0．05）；电解质相应指标及葡萄糖水平趋于正常。结论吸入麻醉在犬实验中是安全有效的。

人脐带间充质干细胞对小鼠抗疲劳及抗缺氧能力的影响

目的探讨人脐带间充质干细胞（HUCMSCs）对小鼠抗疲劳及抗缺氧的作用。方法正常健康雄性昆明小鼠50只，随机分为正常饲养组、对照组及HUCMSCs高、中、低剂量组，其中高、中、低剂量组尾部静脉注射不同剂量HUCMSCs，对照组尾部静脉注射生理盐水，连续注射3d后分别进行小鼠转棒实验，之后检测小鼠肌糖原、肝糖原、血清尿素氮、血清乳酸、血清尿素氮含量。另取小鼠120只，随机分为对照组及HUCMSC高、中、低剂量组（各组处理方法同小鼠转棒实验），分别进行小鼠常压耐缺氧实验、硝酸钠中毒实验，观察小鼠存活时间并检测小鼠血红蛋白数目。结果与对照组比较，HUCMSCs高剂量组能够显著延长小鼠在转棒上的停留时间[（2．5±1．5）min比（6．6±2.3）min，P〈0．05]，改善其疲劳相关生化指标[MG（0．99±0．13）mg·g-1比（1．27±0．19）mg·g-1、LG（30．8±6．4）mg·g-1比（39．3±7．5）mg·g-1、SUN（6．8±1．3）mmol·L-1比（5．3±0．9）mmol·L-1、SLA（6．9±0．7）mmol·L-1。比（5．6±0．9）mmol·L-1、CK（0．68±0．15）kU·L-1比（O．55±0．14）kU·L-1，P〈0．05]，且能够延长小鼠缺氧存活时间[耐缺氧时间（28．3±5．5）min比（36．3±8．9）min、亚硝酸钠中毒缺氧时间（14．3±3．8）min比（21．5±6．7）min，P〈0．05]。结论人脐带间充质干细胞能够增强小鼠的抗疲劳及抗缺氧能力。

乌司他丁预先给药对双下肢缺血再灌注损伤后血浆细胞因子的影响

目的探讨乌司他丁预先给药对双下肢缺血再灌注损伤后血浆细胞因子的影响。方法 30例择期双下肢需上止血带(>150 min)手术的患者,随机分为:对照组(NC组,n=10)、乌司他丁预先给药组(UP1组,n=10)和乌司他丁治疗组(UP2组,n=10)。UP1组于首次上止血带前15 min静脉滴注乌司他丁按6000 U/kg,末次松止血带前15 min再次静脉滴注6000 U/kg;UP2组末次松止血带前15 min给予乌司他丁静脉滴注12 000 U/kg;NC组:末次开放止血带前15 min静脉滴注等容积生理盐水(均10 min内滴完)。3组患者首次上止血带前20 min(缺血前)、末次松止血带后30 min(再灌注后30 min)及术后(再灌注后)1 d、3 d和7 d,取外周血检测血浆C反应蛋白(CRP)、白介素-6(IL-6)、和肿瘤坏死因子(TNF-α)水平。结果与缺血前比较,再灌注后30 min、1 d及3 d,3组患者血浆CRP、IL-6、TNF-α水平均显著升高(P<0.05),但UP1组、UP2组与NC组相比明显低于后者[CRP:1 d(11.15±2.32)、(10.48±2.08)mg/l比NC(15.83±4.56)mg/l,3 d(4.29±1.89)、(3.89±1.34)mg/l比NC(6.78±2.95)mg/l;TNF-α:1 d(31.24±8.66)、(29.72±8.77)ng/l比NC(44.802±11.70)ng/l,3d(13.75±5.11)、(15.73±4.16)ng/l比NC(20.787±8.05)ng/l;IL-6:1 d(160.80±46.95)、(179.72±35.77)ng/l比NC(329.50±95.34)ng/l,3 d(45.32±16.53)、(53.35±17.62)ng/l比NC(79.33±24.93)ng/l,P<0.05],UP2组与UP1组间比较差异均无统计学意义;再灌注后7 d 3组患者血浆细胞因子均恢复正常。结论乌司他丁预先给药可有效地减轻双下肢缺血再灌注所引起的全身炎性反应,使血浆CRP、IL-6、TNF-α上升幅度明显受抑,从而可有效地阻抑炎性因子介导的组织器官损伤。

全新含氮化合物消毒剂杀菌效果研究

目的研究含氮化合物消毒剂杀灭微生物最优效果和最佳结合浓度。方法配置浓度为1%、2%、3%的含氮化合物消毒剂各4 ml为试验组1、试验组2、试验组3,磷酸盐缓冲液4 ml为阳性对照组,分别与浓度为105芽孢悬液作用10、20、30 min三个时间段,取0.5 ml依次划种于营养琼脂培养基,37℃恒温培养箱培养48 h,观察有无芽孢生长,取与此次实验相关的溶液,分别与磷酸盐缓冲液混匀作为阴性对照组,进行平行试验。结果浓度为2%的消毒剂作用30 min平均菌落数为0,浓度为3%的消毒剂作用20 min时平均菌落数为0,其余浓度消毒剂作用各时间段均有菌落生长,阴性对照组均未长出菌落。结论本消毒剂能够有效杀灭芽孢,浓度为2%时作用30 min,浓度为3%时作用20 min对枯草杆菌黑色变种芽孢的清除率均为100%。

二甲双胍对ALDH^+胃癌干细胞的抑制作用及其机制

目的探讨二甲双胍(Met)对乙醛脱氢酶(ALDH)阳性胃癌干细胞的抑制作用及其可能机制。方法选择人胃癌细胞系MKN45作为亲本细胞,采用流式细胞仪分选出ALDH^+和ALDH~–细胞,进行自我更新能力、分化能力、裸鼠移植瘤实验,鉴定其是否为胃癌干细胞及是否具备肿瘤干细胞特性。实验设置1mmol/L Met组、5mmol/L Met组和MKN45细胞组,分别作用48h后,检测各组ALDH^+细胞的比例;RT-PCR实验检测各组Oct4、Sox2、AKT基因表达量的变化。结果细胞鉴定实验结果显示,ALDH^+细胞的自我更新能力、分化能力、致瘤能力均高于ALDH~–细胞,表明ALDH^+细胞具有肿瘤干细胞特性。实验结果显示,MKN45细胞组、1mmol/L Met组、5mmol/L Met组ALDH^+细胞比例分别为36.5%±5.4%、15.6%±1.9%和7.6%±1.6%,三组差异有统计学意义(P<0.01)。RT-PCR结果显示,Met处理后Sox2和AKT基因的表达量均下降,且随Met浓度升高下降更为明显;Oct4基因在1mmol/L Met组的表达量高于MKN45细胞组,5mmol/L Met组的表达量低于MKN45细胞组。结论 Met能抑制ALDH^+胃癌干细胞生长,抑制AKT基因的表达,可作为临床治疗胃癌的靶点药物。

亲和吸附材料应用于血液灌流治疗外源性内毒素血症的安全性研究

目的评估课题组研发的亲和吸附材料特异清除外源性内毒素的安全性。方法 15只比格犬静脉输注内毒素(Sigma)复制内毒素血症模型,随机分为治疗组(n=10)和对照组(n=5),治疗组用课题组研发的一次性血液灌流器进行干预,对照组不用该灌流器。实验前后监测生命体征并于灌流开始、灌流60及120 min采集血液标本检测生化、血常规和凝血功能。结果治疗组体温及呼吸在灌流后逐步下降,对照组则上升。灌流开始、灌流120 min治疗组血小板(PLT)为(222.50±14.19)×10~9/L、(199.00±18.18)×10~9/L,对照组为(233.91±12.22)×10~9/L、(222.07±7.62)×10~9/L,两组比较,差异有统计学意义(P<0.05);灌流开始、灌流120 min治疗组白细胞(WBC)为(7.14±0.10)×10~9/L、(6.10±0.19)×10~9/L,对照组为(7.17±0.11)×10~9/L、(5.52±0.54)×10~9/L,两组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、总蛋白(TP)、球蛋白(GLO)治疗组灌流120 min与灌流开始比较,均差异有统计学意义(P<0.05),灌流120 min均下降;对照组灌流120 min与灌流开始比较,均差异有统计学意义(P<0.05),灌流120 min均上升。尿素(Urea)、肌酐(Cr)、尿酸(UA)治疗组灌流120 min后呈下降趋势,对照组则轻微上升。结论该亲和吸附材料清除实验犬血液中的内毒素具有安全性。

胃癌细胞表面ALDH1表达及ALDH1^+细胞的“干性”鉴定

目的检测胃癌细胞系的乙醛脱氢酶1(ALDH1)表达,鉴定ALDH1^+细胞生物学特性。方法采用Aldefluor实验方法,通过流式细胞仪检测胃癌细胞系MGC-803、BGC-823及MKN-45中ALDH1的活性表达;选取MGC-803细胞系,分选出ALDH1^+和ALDH1^-细胞,进行分化潜能、平板克隆、耐药性、干性相关基因检测及裸鼠成瘤实验。结果MGC-803、BGC-823及MKN-45中ALDH1的表达比例为(13.00±1.34)%、(5.80±2.15)%及(36.5±5.4)%;分选出ALDH1^+、ALDH1^-细胞组,含血清培养1周后,ALDH1^+的表达比例为21.2%和3.9%,ALDH1^+细胞具有不对称分裂能力;ALDH1^+细胞组克隆形成率为(42.63±0.63)%,高于ALDH1^-细胞组(18.5±2.04)%,两组比较差异有统计学意义(P<0.05);相同氟尿嘧啶浓度下,ALDH1^+组生长抑制率均低于ALDH1^-组,差异有统计学意义(P<0.05);接种5×10~3个ALDH1^+及ALDH1^-细胞于小鼠皮下成瘤,与ALDH1^-细胞比较,ALDH1^+细胞成瘤率高。两组肿瘤体积比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论胃癌细胞系普遍存在ALDH1的活性表达,ALDH1^+细胞具有干细胞生物学特性,可能提供胃癌新的诊断和治疗途径。

亲和吸附材料特异性清除外源性内毒素有效性的研究

目的研究本课题组研发的亲和吸附材料特异清除外源性内毒素的有效性。方法 15只比格犬静脉输注内毒素制造内毒素血症模型后随机分为治疗组(n=10)和对照组(n=5),治疗组用本课题组研发的一次性血液灌流器进行干预,对照组不用该灌流器。在灌流开始、120 min测定犬血液中内毒素及肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素1β(IL-1β)、白介素6(IL-6)、白介素8(IL-8)的水平;灌流过程中监测犬的生命体征。结果造模成功后,治疗组、对照组灌流开始血液中内毒素水平分别为(118.63±27.98)、(117.16±22.95)EU/m L,灌流120 min分别为(0.039±0.01)、(131.98±7.01)EU/m L,治疗组灌流后内毒素清除率达94.07%。灌流开始治疗组血液中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8水平分别为(1.53±0.27)、(12.82±1.66)、(54.77±3.98)、(0.25±0.32)ng/m L,对照组分别为(1.53±0.06)、(13.05±0.18)、(54.58±0.19)、(0.28±0.06)ng/m L;灌流后120 min治疗组血液中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8水平分别为(0.13±0.06)、(0.70±0.36)、(1.62±0.80)、(0.01±0.00)ng/m L,对照组分别为(2.26±0.15)、(15.12±0.18)、(62.54±0.93)、(0.73±0.93)ng/m L,两组灌流开始与120 min各指标分别相比,差异有显著性(P<0.05)。结论该亲和吸附材料能有效清除实验犬血液中的内毒素及炎症介质,清除率达94.07%。

损伤软骨的细胞提取、鉴定及生物学活性研究

目的对从膝关节软骨损伤区分离出的细胞进行鉴定,并对其生长活性进行研究,以解决自体软骨细胞移植中软骨细胞来源不足的问题。方法通过膝关节镜,在软骨损伤区取少量损伤软骨组织,不含正常软骨及软骨下骨为实验组;取正常软骨组织为对照组。在胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶作用下从实验组中提取细胞,对照组中提取正常软骨细胞。实验组细胞培养贴壁后在倒置相差显微镜下观察细胞的形态是否与对照组软骨细胞一致。实验组细胞行甲苯胺蓝染色鉴定,与对照组对比;噻唑蓝(MTT)法比较两组细胞生长活性;以具有专利知识产权的Ⅰ/Ⅱ型复合胶原膜为生长载体,培养实验组和对照组第3代软骨细胞,在电镜下观察两组生长活性。结果从少量损伤的软骨组织中提取的细胞为活性正常的软骨细胞,其特征及生长活性与对照组比较,差异无统计学意义(P<0.05)。结论软骨损伤过程中软骨细胞未发生变性,少量损伤的软骨组织仍可获得适量软骨细胞,MTT法和电镜扫描表明,其生长活性符合自体软骨细胞移植的要求,无需取正常软骨组织作为细胞来源。

犬内毒素血症模型的建立及评价

目的 建立犬的内毒素血症模型并进行评价,为内毒素血症的研究提供更为切合临床、更便于治疗研究的动物模型.方法 运用阑尾结扎穿孔的方法模拟,临床上阑尾炎导致腹膜炎而引起内毒素血症,造模后通过观察和监测实验动物的一般情况、内毒素的水平、血生化血常规及细胞因子来对模型进行评价.结果 造模后,实验犬出现了少动、精神萎靡及大小便异常等情况;与造模前相比,造模后12 h血中内毒素上升达到1.06 Eu/mL,差异有统计学意义,P〈0.05,造模后24 h内毒素为1.96 Eu/mL,且维持在高水平状态;造模后12 h白细胞和淋巴细胞的水平下降,与造模前相比差异有统计学意义P〈0.05;造模后24 h谷丙转氨酶、谷草转氨酶和血清尿素氮达到较高水平,与造模前相比差异有统计学意义P〈0.05;炎症因子IL-1α、IL-6、TNF-α及IL-10在造模后24 h也出现高水平.结论 本实验成功的建立了犬内毒素血症模型,为后期临床治疗研究提供理想的动物模型.

侧脑室置管对大鼠长时记忆提取功能的影响

目的观察侧脑室置管技术对大鼠长时记忆提取功能的影响。方法SD大鼠134只，2只在侧脑室置管后用于观察定位是否准确，其余大鼠进行水迷宫训练后随机编入对照组（n=12）、未置管组（n：60）、置管组（n=60）；未置管组及置管组术后分别于后6、12、24h、3、7d再次进行水迷宫测试，记录逃避潜伏期、穿越平台次数及在目标象限停留时间并绘制轨迹图；水迷宫测试后取脑组织，行尼氏染色以观察尼氏体形态学变化，酶联免疫吸附试验（EHSA）检测海马组织大鼠脑源性神经营养因子（BDNF）含量。结果未置管组较对照组差异无统计学意义（P〉0．05），置管组术后6h逃避潜伏期较对照组延长[（37．84±24．32）s比（26．78±17．38）s，P〈0．05]，穿越平台次数及在目标象限停留时间减少[（2．83±1．34）次比（4．72±1．80）次、（23．74±8．30）s比（29．67±13．93）s，P〈0．05]，轨迹图较其余各组杂乱且分散；尼氏染色示置管组神经元尼氏体与对照组差异无统计学意义（P〉0．05）；置管组与对照组的BDNF含量在置管后3、7d比较差异无统计学意义[（171．64±11．16）pg／ml比（167．65±11．04）pg／ml、（162．33±9．14）pg／ml比（167．65±11．04）pg／ml，P〉0．05]。结论置管后大鼠的长时记忆提取功能短暂下降后可很快恢复并维持在正常水平。

硫酸软骨素促进成肌细胞增殖作用的研究

目的探讨硫酸软骨素(chondroitin sulfate,CS)对成肌细胞增殖以及肌管形成的影响。方法取第5代成肌细胞制成浓度为1×108个/L的细胞悬液,依据在成肌细胞培养基中添加不同浓度CS,将实验分为A组(0μg/m L)、B组(50μg/m L)、C组(100μg/m L)和D组(200μg/m L)。干预4、5、8 d于倒置显微镜下观察各组细胞形态学变化及肌管形成情况,6 d采用MTT法检测各组细胞增殖情况,8 d行HE染色检测各组细胞肌管形成数。结果倒置显微镜观察示,细胞贴壁后呈单核梭形,细胞核呈卵圆形,细胞质致密;贴壁90%时整体肌母细胞呈漩涡状走行,长梭状生长。继续培养成肌细胞细胞核出现融合现象,形成多核肌管。8 d,A组细胞多数已融合形成肌管,B、C组细胞有部分未融合,D组细胞融合形成肌管数最少。MTT检测示,A、B、C、D组活细胞吸光度(A)值分别为0.045 2±0.004 4、0.540 4±0.096 7、0.660 9±0.143 4、1.069 0±0.039 0,A组显著小于B、C、D组,B、C组小于D组,差异均有统计学意义(P<0.05);B、C组间差异无统计学意义(P>0.05)。HE染色示,A组细胞大多数已融合形成肌管;B、C组有少部分细胞未融合形成肌管;D组细胞融合形成肌管数相对最少,未融合细胞数稍多。A、B、C、D组肌管形成数分别为(222.01±30.02)、(193.13±42.46)、(170.26±11.96)、(136.88±16.78)根,各组间比较差异无统计学意义(F=1.658,P=0.252)。结论 CS显著促进成肌细胞增殖,200μg/m L CS促成肌细胞增殖能力显著优于其他浓度。