烯丙孕素缓释微球的制备及特性研究

为提高烯丙孕素的生物利用度,减少给药次数,降低猪场的养殖成本,旨在制备一种具有缓释长效性能的烯丙孕素缓释微球。以单甲氧基聚乙二醇-聚乳酸共聚物(mPEG-PLA)为载体材料,采用乳化-溶剂挥发法制备烯丙孕素缓释微球,在模拟胃肠道环境的溶出介质中测定烯丙孕素缓释微球的体外释放情况,并对烯丙孕素缓释微球的药物稳定性进行考察。结果显示,烯丙孕素缓释微球的最佳制备条件为搅拌速度1000 r/min,水相中吐温-80含量0.2%,mPEG-PLA质量浓度0.07 g/mL,油水体积比0.6,水相中明胶含量1.0%;以最佳制备条件制得的烯丙孕素缓释微球平均包封率为(95.64±0.23)%,平均载药量为(9.83±0.61)%,mPEG-PLA对烯丙孕素的包埋效果最佳。烯丙孕素缓释微球呈球形或近球形,外观圆整,平均粒径为82.3μm。烯丙孕素缓释微球能在分别含1%吐温-80,pH 1.2、pH 4.1以及pH 6.8这3种不同溶出介质中持续释放4 h以上,且释放机理符合一级动力学方程。烯丙孕素缓释微球在高湿环境中的稳定性良好,但在高温和强光照射的条件下储存10 d时,烯丙孕素的含量分别下降3.00%和11.92%。烯丙孕素缓释微球具有缓释的性能,且制备方法简单,包封率高,载药量好,易于产业化生产,可进一步推动烯丙孕素在养猪业的开发利用。

猫子宫内膜上皮细胞的分离培养与生物学特性

为了分离、纯化、培养猫子宫内膜上皮细胞并分析其生物学特性,本试验采用胰蛋白酶消化法+组织块培养法,于体外分离和培养子宫内膜上皮细胞,并采用免疫荧光法对其进行鉴定;测定第3代(P3)细胞生长曲线和群体倍增时间,比较P3和P6细胞克隆形成率。结果显示:猫子宫内膜上皮细胞呈典型铺路石状,细胞角蛋白染色呈阳性,符合内膜上皮细胞特征;P3细胞生长曲线呈典型S型;P3子宫内膜上皮细胞群体倍增时间为(22.73±2.05)h,其克隆形成率极显著高于P6(P<0.01)。结果表明:本试验采用胰蛋白酶消化法+组织块培养法分离获得的猫子宫内膜上皮细胞具有良好的体外增殖能力。

圈养孟加拉虎脂肪间充质干细胞的分离培养和生物学特性

圈养孟加拉虎(Panthera tigris tigris)是保护该濒危物种的有效途径,但限制性的圈养环境导致圈养虎的健康问题日益凸显,尤其是肾炎,当前的治疗方法预后效果较差。为分离获取、鉴定并培养具有治疗孟加拉虎肾炎治疗潜力的孟加拉虎脂肪间充质干细胞,通过采集孟加拉虎的脂肪组织,利用Ⅰ型胶原酶消化法分离脂肪间充质干细胞并进行传代培养;采用CCK8法测定P3、P6和P9代细胞活性并绘制生长曲线;采用PCR法扩增间充质干细胞表面特殊标记物基因;通过成脂肪和成骨诱导分化试验分别测定脂肪间充质干细胞的成脂与成骨诱导分化能力。结果发现:孟加拉虎脂肪间充质干细胞为长梭形,折光性较好,生长情况良好;P3、P6和P9代细胞生长曲线呈典型的“S”型,符合间充质干细胞生长曲线规律;PCR扩增得到CD44、CD90、CD105和CD29特异性表面标记物基因;诱导分化试验表明,脂肪间充质干细胞具有成脂成骨诱导分化能力。综上,分离培养获得的细胞符合间充质干细胞特征,表明成功分离出孟加拉虎脂肪间充质干细胞。虎脂肪间充质干细胞的成功分离将作为一种潜在的细胞治疗手段,可能为虎肾炎的治疗提供新的选择,有望在维持虎的健康状态和延长寿命方面产生积极的临床效果。

大肠杆菌O-抗原血清型鉴定研究进展

大肠杆菌在一定条件下能引发宿主疾病,其表面O-抗原与毒力有关。O-抗原的化学组成和结构具有高度多样性,并且O-抗原血清型种类与大肠杆菌致病性有一定联系。因此,大肠杆菌O-抗原血清型鉴定对流行病学调查,防御和控制致病性大肠杆菌病有重要意义。传统的血清学分型方法耗时长、费用高、准确度不理想。随着科学技术的发展,研究者对大肠杆菌196种O-抗原基因簇进行了破译,比较分析了不同O-抗原基因簇序列,并针对基因簇中特异性DNA序列设计分子标记,运用PCR方法对O-抗原血清型进行分型,其中包括一般PCR、多重PCR、实时PCR、DNA芯片和微球悬浮列阵法。此外,还有rbf-限制性片段长度多态性分析法,磁性微球免疫分析法和基于全基因组序列预测法,这些方法丰富了O-抗原血清型鉴定方法,弥补了传统血清学分型方法的不足。本文概述了O-抗原合成基因簇序列和O-抗原血清型鉴定方法相关研究进展。

猪源β-防御素2和3的研究进展

防御素是一类阳离子抗菌肽,广泛存在于动物和植物体内。猪源β-防御素2和β-防御素3能抵抗猪体内病原微生物,并能调节机体免疫功能,对生殖发育也有一定的生理作用。猪源β-防御素2能促进仔猪生长,对猪红细胞毒性低,能在毕赤酵母中高效表达,其转基因猪也具有较好的抗病性能。因此,猪防御素具有潜在的应用价值。本文就猪源β-防御素2和β-防御素3在体内的表达分布和调控因素、参与调节的信号通路、在生殖发育和畜牧养殖方面的新功能及应用潜力进行综述。

猪链球菌3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的原核表达、活性检测和同源建模

旨在以猪链球菌(Streptococcus suis,S.suis)3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)为药靶,给S.suis病防治研制新型抗菌药提供理论和试验基础。原核表达了S.suis HMGR,用Ni-NTA树脂对重组蛋白质进行了纯化,并用分光光度法测定了其酶活力。此外,运用CLUSTALW对同源HMGR氨基酸序列进行多序列比对。通过SWISS-MODEL对S.suis HMGR三维结构进行同源建模,并用PROCHECK评价模型的质量。酶活力测定结果显示,催化HMG-CoA还原为甲羟戊酸的反应中,S.suis HMGR最佳反应温度和pH分别为37℃和5.0,其Vmax和Km为846U·mg-1和0.213mmol·L-1。经分析显示,肺炎链球菌HMGR晶体结构(PDB ID:3QAE_A)是构建S.suis HMGR三维结构的最佳模板。构建的三维结构模型经质量评估证实为可靠的理论模型,将有助于虚拟筛选出对抗S.suis感染的新型抗生素,酶活力的测定为用试验手段验证S.suis HMGR抑制剂的有效性提供了可行性的方法。

禽源致病性大肠杆菌的耐药性和毒力基因研究

为了解广东省佛山市禽源致病性大肠杆菌抗生素敏感性及其毒力因子携带情况,采集疑似禽大肠杆菌患病禽的肝脏和肺脏病料,用于禽源致病性大肠杆菌的分离培养、形态学观察、生化鉴定,并运用药敏片检测菌株对13种抗菌药的体外敏感性,采用PCR方法调查了9种毒力因子携带情况。结果显示:108株分离株的生化特性基本一致;所有菌株均具有5种以上的药物耐受性,95%以上对阿莫西林、氯霉素和头孢氨苄耐受,56.48%以上菌株对所检测的12种抗菌药耐受;分离株pap C和vat基因的检出率最低分别为2.78%和5.56%,分布率最高的基因为iuc D(74.07%)、iss(62.96%)、tsh(56.48%)和hly F(55.56%);耐药性和毒力之间的分析结果表明,25%的菌株是含有5种以上毒力基因的强毒株,强毒株中66.67%的菌株对12种抗菌药耐受。

鸡性别决定机制和调控的研究进展

动物性别决定机制的研究在遗传育种领域具有重要意义。根据实际生产需要,定向调控鸡的性别能为我国家禽养殖产业带来极大的经济效益,在新品种培育和疾病防控方面也可发挥重要作用。文章主要从鸡的性别决定假说及性别决定基因两个方面概括了近年来在鸡性别决定机制方面的研究进展,同时简述了鸡性别调控技术。

鸭疫里默氏杆菌耐药现状及耐药机制研究进展

鸭疫里默氏杆菌作为常见的水禽病原体之一,能够引发鸭、鹅等鸭疫里默氏杆菌病,该病分布广泛,传播迅速且死亡率高。虽然抗生素有效减少了该病带来的经济损失,但是由于抗生素在治疗和促生长过程中的大量使用,导致鸭疫里默氏杆菌的耐药性正在逐年升高。文章就鸭疫里默氏杆菌对大环内酯类、氨基糖苷类、四环素类等抗生素,特别是替加环素的耐药性以及耐药机制进行系统分析,以期能对鸭疫里默氏杆菌病的防治提供理论依据。

2007至2020年浙江省动物源细菌耐药性监测进展

畜禽养殖中抗生素滥用造成动物源耐药细菌大量产生与传播,已经成为重点关注的公共安全问题。我国细菌耐药情况较为严重,对于动物源细菌耐药性关注度亟待加强。本文将从浙江省近年动物源大肠埃希菌、弗格森埃希菌、沙门菌、弯曲杆菌、肠球菌及葡萄球菌的分离情况、耐药情况以及所发现的获得性耐药基因方面进行综述,为畜禽养殖行业的科学合理用药提供理论指导,完善动物源细菌耐药监测网,为抗菌药减量化行动提供依据,以期更好地遏制浙江省动物源细菌耐药性问题。

犬脐带间充质干细胞来源外泌体修复皮肤创伤

背景:研究发现,间充质干细胞来源的外泌体具有抑制炎症、促进皮肤细胞增殖和血管再生、减少肌成纤维细胞积累的作用,表明间充质干细胞主要通过旁分泌方式修复损伤,给皮肤损伤治疗提供了新方法。但应用犬脐带间充质干细胞来源外泌体治疗皮肤创伤的研究甚少。目的:研究犬脐带间充质干细胞来源的外泌体对犬皮肤创伤的修复作用,并探讨其作用机制。方法:选取年龄相近的健康中华田园犬12只,在背部正中肩胛骨下方皮肤做4 cm×4 cm正方形切口,然后随机分成外泌体组和模型组,每组6只。外泌体组在创口周围注射1 m L质量浓度为300 mg/L犬脐带间充质干细胞来源外泌体溶液,模型组注射等量生理盐水。造模前后每天观察犬的精神状况和创面愈合情况,定时检测血常规和创口面积,并于第1,2,4周进行病理组织观察。结果与结论:在造模后第1周,模型组出现了明显炎症反应,白细胞数量也较造模前升高了30%,而外泌体组炎症反应不明显,白细胞总数和中性粒细胞升高速度较模型组慢;两组的淋巴细胞数和红细胞数无明显差异。治疗组肉芽组织生长和伤口愈合速度较模型组快,但无显著性差异。结果提示,犬脐带间充质干细胞来源外泌体具有一定抑制炎症和促进皮肤创面愈合的作用。

犬脐带间充质干细胞来源外泌体对血管内皮细胞增殖、迁移和凋亡的调控作用

背景:以往研究发现,脐带间充质干细胞来源外泌体具有促进犬皮肤伤口愈合的作用,但犬脐带间充质干细胞来源外泌体对血管再生的作用机制尚未明确。目的:探讨犬脐带间充质干细胞来源外泌体对血管内皮细胞增殖、迁移及凋亡能力的影响及其机制。方法:采用低温超高速离心法分离犬脐带间充质干细胞来源外泌体;采用血管内皮机械剥离和Ⅰ型胶原酶消化法分离犬血管内皮细胞并通过表面标记和分化特性对其进行鉴定。使用CCK-8法、划痕实验和Annexin V流式检测法测定犬脐带间充质干细胞来源外泌体对血管内皮细胞增殖、迁移和凋亡的影响,高通量测序检测犬脐带间充质干细胞来源外泌体中miRNA的表达并探讨其可能性机制。结果与结论:实验成功建立了犬动脉血管内皮细胞的分离与培养方法,其形态呈铺路石状,阳性表达CD34和CD31表面蛋白;犬脐带间充质干细胞来源外泌体能显著促进血管内皮细胞增殖与迁移,抑制内皮细胞凋亡,而其作用机制可能是其中富含丰富的miRNA。

犬脂肪间充质干细胞及其外泌体修复庆大霉素致犬肾小管上皮细胞损伤

背景:犬肾脏损伤的特点是肾小管上皮细胞凋亡坏死。最近研究表明间充质干细胞及其外泌体在人、大鼠、小鼠肾损伤治疗中显示出良好的效果,但对犬的研究甚少。目的:探讨犬脂肪间充质干细胞及其外泌体对庆大霉素致犬肾小管上皮细胞损伤的影响。方法:采用5 mmol/L硫酸庆大霉素处理犬肾小管上皮细胞,随后分别将犬脂肪间充质干细胞及其条件培养基和外泌体与受损犬肾小管上皮细胞共培养。在24 h及48 h后采用CCK-8法测定各组细胞增殖活力,流式细胞术检测各组细胞凋亡率,最后通过Q-PCR法检测PCNA、Bcl-2和Bax基因的表达。结果与结论:犬脂肪间充质干细胞及其条件培养基和外泌体均可显著促进受损犬肾小管上皮细胞增殖以及减少细胞凋亡(P<0.05),其中犬脂肪间充质干细胞外泌体的效果最好,可显著提高受损犬肾小管上皮细胞PCNA、Bcl-2基因的表达(P<0.05),对庆大霉素诱导的犬肾小管上皮细胞损伤发挥修复作用。

miRNA调节卵泡颗粒细胞凋亡及其机制的研究进展

微小核糖核酸(microRNA,miRNA)是一类内源性非编码RNA,具有广泛的基因表达调控作用,可以在转录后水平通过影响靶基因来调控相应蛋白质的表达,进而调节细胞的生命活动。miRNA在哺乳动物卵泡颗粒细胞中表达,并调控颗粒细胞的凋亡。颗粒细胞作为卵巢卵泡中数量最多的细胞群,在卵泡发育过程中起着至关重要的作用,不仅为卵母细胞提供营养物质,还调控其发育和成熟。颗粒细胞凋亡是导致卵泡闭锁的重要原因,影响卵泡的数量和质量从而影响雌性动物的繁殖性能。颗粒细胞凋亡过程受多种因素的调控。文章简述了miRNA对卵巢颗粒细胞凋亡的调控作用及其机制,其中包括miRNA通过调控激素分泌和细胞凋亡相关因子的表达进而调节颗粒细胞的凋亡,miRNA对颗粒细胞凋亡相关信号通路的影响,miRNA调控颗粒细胞凋亡导致的卵巢相关疾病,并总结了对颗粒细胞凋亡有调控作用的miRNA,以及miRNA在疾病诊断和治疗中的潜在作用,以期为后续相关卵巢疾病的发病机制和治疗方案研究,以及提高雌性哺乳动物生殖性能提供指导和参考。

脂肪源间充质干细胞治疗犬急性肾衰竭的疗效观察

为了研究犬异体脂肪源间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cell,MSC)移植对钩端螺旋体引起的急性肾衰竭(Acute renal failure,ARF)的治疗效果。采用Ⅰ型胶原酶消化法分离犬的脂肪MSC;通过静脉注射MSC对1例钩端螺旋体引起的急性肾衰竭犬进行治疗。结果显示,犬脂肪MSC呈长梭形、三角形或多菱形等形态、贴壁生长;干细胞移植治疗后一周,病犬精神恢复良好,饮食正常,检测血液肌酐和血磷含量下降至正常范围内,尿素氮含量明显下降且接近正常范围。表明犬脂肪MSC移植能有效治疗钩端螺旋体诱发的急性肾衰竭。

低氧培养犬脂肪间充质干细胞的生物学特性

背景:以往研究发现低氧对间充质干细胞增殖、分化及细胞因子分泌等方面均有不同程度的影响,但低氧对犬脂肪间充质干细胞的影响尚未见相关研究。目的:探讨低氧环境对犬脂肪间充质干细胞生物学特性的影响。方法:通过酶消化法分离培养犬脂肪间充质干细胞,第2代时分为常氧组(氧气体积分数为21%)和低氧组(氧气体积分数为5%),比较了两组细胞的形态特征、增殖速度、细胞表面标志物、分化能力和细胞因子分泌水平等。结果与结论:①低氧环境下培养的脂肪间充质干细胞生长状况良好,细胞形态与常氧组一样,均呈梭形和多棱形;②低氧组的细胞增殖速度加快,细胞倍增时间比常氧组短(P均<0.05),成脂、成骨分化出现时间较早;③常氧组和低氧组脂肪间充质干细胞均高表达CD90、CD44和CD105,低表达CD45;④低氧组脂肪间充质干细胞的脑源性神经营养因子和血管内皮生长因子mRNA表达量分别是常氧组的2.3倍(P<0.05)和3.0倍(P<0.05);⑤结果提示低氧环境对脂肪间充质干细胞的形态、表面标记物无明显影响,但对细胞增殖、分化和细胞因子分泌能力有促进作用。

抗菌肽Protegrin-1的研究进展

抗菌肽是机体天然免疫系统的重要组成部分,具有抗病原微生物活性。在抗菌肽Protegrin(PG)家族中,PG1因其有效的抗病原微生物活性和体内的稳定性日益受到关注,是具有前景的疾病治疗候选物,也是研究抗菌肽作用机理的理想模型。本文对PG1的结构特性、基因表达、生物活性、作用机制和相关应用研究等进行综述,为生产中抗菌肽PG1的进一步开发和应用提供参考。

马脂肪间充质干细胞的分离培养与生物学特性试验

为马的关节炎、肌腱和韧带损伤的临床治疗提供种子细胞,本试验通过采集马颈部脂肪组织,采用Ⅰ型胶原酶消化法分离脂肪间充质干细胞,并进行传代培养;绘制细胞生长曲线、测定细胞群体倍增时间;通过流式细胞术检测P3代细胞表面标记物,RT-PCR法扩增细胞表面标记物目的基因片段;油红O和茜素红染色法测定脂肪间充质干细胞的成脂和成骨诱导分化能力。结果发现:马脂肪间充质干细胞体外培养条件下呈长梭形和典型的旋涡状,生长状态良好、折光性强;经测定细胞生长曲线呈典型的"S"型,符合Logistic生长曲线规律;P3、P6和P9代细胞群体倍增时间分别为21.5 h、26 h、36 h;流式细胞术检测结果显示,P3代细胞高表达间充质干细胞表面标志物CD44、CD90和CD105,不表达造血系细胞表面标志物CD45;PCR扩增得到CD44、CD90、CD105和CD73特异性目的片段;油红O和茜素红染色证明,马脂肪间充质干细胞具有成脂和成骨诱导分化能力。

猫血清白蛋白在毕赤酵母中的分泌表达

【目的】在毕赤酵母中构建猫血清白蛋白(feline serum albumin,FSA)表达系统,并探索其最适的基本表达条件,为FSA的生产提供一种新方法。【方法】在GenBank上获取FSA碱基序列,进行密码子优化并合成,将优化的密码子构建到载体pPIC9K上,经PCR和双酶切验证后通过电击转化将重组质粒FSA-pPIC9K转化毕赤酵母GS115,依次经MD平板和G418筛选后进行菌落PCR获得阳性菌株,随机选取阳性菌株经甲醇诱导表达96 h后,取表达上清液进行Western blotting验证。选取表达量较高的菌株分别在不同温度(24、26、28和30℃)、pH(4.0、5.0、6.0、7.0和8.0)和甲醇诱导量(其中1组为每24 h添加0.5%,其余4组为每12 h分别添加0.5%、1.0%、1.5%和2.0%)的条件下诱导表达96 h,取表达上清液进行Western blotting验证。【结果】菌落PCR结果显示,获得2条大小分别约为2.3和2.2 kb的目的基因条带和毕赤酵母AOX1基因扩增条带,诱导表达96 h后取表达上清液进行Western blotting验证,在70 ku左右出现特异性条带。通过基本条件优化发现该蛋白在28℃,pH为6.0且每12 h添加0.5%的甲醇条件下表达量较高。【结论】毕赤酵母GS115可稳定表达FSA。

α-酮戊二酸二甲酯预处理对犬脂肪间充质干细胞氧化应激损伤的保护作用

研究旨在探究α-酮戊二酸二甲酯(dimethylα-ketoglutarate,DMKG)预处理对犬脂肪间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells,ADSCs)抗氧化应激损伤的影响。以含0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L过氧化氢(H_(2)O_(2))的DMEM/F12基础培养基处理犬ADSCs,1 h后采用CCK-8法检测细胞存活率,筛选最适浓度以建立犬ADSCs氧化应激模型。选取生长良好的P3代犬ADSCs分为3组,分别为空白对照组、模型组、DMKG组。空白对照组正常培养,不作处理;模型组使用最佳浓度的H_(2)O_(2)溶液处理犬ADSCs 1 h;DMKG组使用1 mmol/L DMKG预处理犬ADSCs 24 h后,使用最佳浓度的H_(2)O_(2)溶液处理犬ADSCs 1 h。培养结束后,采用CCK-8法检测各组的细胞存活率,可见分光光度法检测还原型谷胱甘肽含量,荧光探针DCFH-DA检测活性氧水平,Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡率,实时荧光定量PCR检测超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(catalase,CAT)、抗凋亡相关基因Bcl-2和促凋亡相关基因Bax、Cleaved-Caspase3的mRNA表达水平。结果显示,与模型组相比,DMKG预处理能有效减少细胞内活性氧的产生(P<0.05),增加细胞存活率(P<0.01),并抑制细胞凋亡(P<0.05);同时,DMKG预处理可增加还原型谷胱甘肽含量(P<0.01),上调相关抗氧化酶基因SOD1、SOD2(P<0.01)和CAT(P<0.05),下调凋亡基因Cleaved-Caspase3的表达水平(P<0.05),增加Bcl-2/Bax的比值(P<0.05)。综上所述,DMKG预处理可显著提高犬ADSCs抗氧化、抗凋亡的能力,从而增加犬ADSCs在氧化应激条件下的存活。